秦 琴，張芮瑞，邱樹毅，陳佳興，周少奇，王雪酈,3

(1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025； 4.貴州科學院，貴州 貴陽 550001)

磷是植物生長所需的重要元素，雖然其在土壤中含量較高，但95%以上為無效磷[1]，難以被植物吸收利用。我國耕地土壤74%都處于缺磷狀態(tài)[2]，含磷肥料的施用成為增加土壤肥力的重要手段。目前，我國農(nóng)用磷肥主要由磷礦加工而來，加工過程配合使用大量強酸，不僅增加了產(chǎn)品成本，而且在施用后，大部分磷與土壤中的鈣離子(Ca2+)、鎂離子(Mg2+)、鐵離子(Fe3+)、鋁離子(Al3+)結合，形成難溶的螯合磷酸鹽，可迅速被土壤中的微生物固持或被礦物吸附固定而降低磷的利用率[3-4]，長期施用含磷肥料還會造成土壤板結和環(huán)境污染。除此之外，我國磷礦資源以中低品質為主，需要選礦加工后才能進行磷肥生產(chǎn)，增加了磷肥生產(chǎn)成本的同時，還導致了大量磷尾礦渣殘留[5]。目前，磷尾礦渣的綜合利用率較低，主要采用堆置的方法進行處理，不僅占用土地，還存在一定的環(huán)境隱患。

如何提高土壤中有效磷含量，同時減少化學磷肥和磷尾礦對環(huán)境的污染，是目前急需解決的難題。大量研究發(fā)現(xiàn)，解磷微生物能將磷尾礦中難溶性磷轉化為可利用磷[6]。因此，借助解磷微生物的轉化作用，將磷尾礦制成生物磷肥是解決上述難題的一種有效途徑。解磷微生物發(fā)酵產(chǎn)生的生物磷肥增產(chǎn)效果往往超過普通的化學磷肥[4]，生物磷肥還能改良土壤、修復環(huán)境，對農(nóng)業(yè)發(fā)展和環(huán)境保護具有重要意義。國內外已經(jīng)開展了許多利用解磷微生物提高難溶性無機磷轉化能力[7-8]以及促植物生長、增產(chǎn)[9-12]的研究。周鑫斌等[13]開展了生物磷肥在石灰性土壤中對磷素轉化影響的研究；賀夢醒等[14]分離篩選到1株具有較好解磷能力的芽孢桿菌，并就其解磷能力和影響解磷能力的條件進行了初步研究；王奎萍等[15]篩選到134株具有代表性的解磷、固氮、產(chǎn)吲哚乙酸菌株，并通過試驗證明，解磷菌株對辣椒的促生效果顯著，辣椒的生物量因此增加了10.24%。目前，國內外針對單株解磷菌解磷能力的研究較多[16-18]，但對復合解磷菌解磷能力的研究相對較少。實際上，在堆肥過程中，各類微生物之間存在復雜的競爭、協(xié)同、拮抗等關系[19]，為發(fā)酵體系接種微生物時必須對此互作機制加以考慮。有研究表明，作為具有特定功能的堆肥接種菌劑，單一菌種很難長久保持較高活性，而復合菌劑則能夠更好地適應堆肥環(huán)境，發(fā)揮更大的作用[20-22]。

基于此，以磷尾礦為主要原料，以富含蛋白質、纖維素和多種微量元素的醬香型白酒酒糟為輔料[23]，將在貴州某磷尾礦堆積場土壤中篩選到的、具有較高解磷能力的菌株PSF7和PSB3制成復合菌液，作用于磷尾礦和酒糟。研究堆肥發(fā)酵過程中磷尾礦用量、菌液接種量和菌種配比對有效磷含量的影響，為生物肥的發(fā)酵選取最優(yōu)條件。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

101-1AB電熱恒溫干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BMJ-250C培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；MJX-250B-Z恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JJ-CJ-IFD型超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；FA-2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；721可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；ZD-85雙功能汽浴振蕩器：金壇市文化儀器有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鉬酸銨等均為市售分析純。

1.2 試驗材料

磷尾礦粉由貴州某磷礦廠提供，醬香型白酒酒糟由貴州仁懷某酒廠提供。

菌株PSB3、PSF7在30℃條件下解磷能力較強(PSB3、PSF7解磷量分別為147.73、98.09 μg/mL)，經(jīng)16S rDNA鑒定，PSB3為嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，PSF7為淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(菌株PSB3培養(yǎng)基)：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL,pH 值7.0～7.4，115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(菌株PSF7培養(yǎng)基)：馬鈴薯浸粉5.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂14.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 值5.8 ～ 6.2，115 ℃滅菌20 min。

上述2種培養(yǎng)基去掉瓊脂即為相應液體培養(yǎng)基。

1.3 復合菌液的制備

將菌株PSB3活化，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h左右，直至含菌量達1×108cfu/mL。同時，將菌株PSF7活化，接種于馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，之后將其挑出混于無菌水中，通過4層滅菌紗布過濾獲得真菌孢子懸液，調節(jié)含菌量至1×108cfu/mL。按照菌種配比(PSF7∶PSB3)(體積比)分別為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的比例將2種菌懸液混合，制成復合菌液。

1.4 固態(tài)發(fā)酵工藝設計

稱取總質量100 g的醬香型白酒酒糟和磷尾礦粉，并按一定比例混合，使得其中磷尾礦用量分別占總質量的5%、10%、15%、20%、25%?；烊?.3中制備的復合菌液，使得菌液接種量分別為總質量5%、10%、15%、20%、25%。攪拌均勻，然后添加蒸餾水，調節(jié)堆體初始水分含量至55%。將堆體置于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每隔24 h翻堆1次并再次調節(jié)堆體水分含量至50%。發(fā)酵72 h，取樣并風干，測定堆體有效磷含量。

1.5 磷含量標準曲線的繪制

參照文獻[24]中磷含量標準曲線的繪制方法。

1.6 有效磷含量的測定

稱取2.50 g(精確到0.01 g)風干后的固態(tài)發(fā)酵堆體試樣于250 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液，塞緊瓶塞并置于振蕩機上，25 ℃、160 r/min振蕩30 min，然后立刻用無磷濾紙過濾，棄去最初的7～8 mL，將剩余濾液收集在100 mL的三角瓶中。吸取10 mL 濾液(若固態(tài)發(fā)酵堆體試樣磷含量超過1 mg/L，可取適量濾液用0.5 mol/L的碳酸氫鈉溶液稀釋至10 mL)。之后用鉬銻抗比色法測定吸光度OD700 nm值，根據(jù)磷含量標準曲線計算待測固態(tài)發(fā)酵堆體試樣中有效磷含量。

1.7 單因素試驗設計

本試驗分別研究磷尾礦用量、菌液接種量、菌種配比(PSF7∶PSB3)這3個因素對堆體中有效磷含量的影響，找出各因素、水平范圍。初步固定發(fā)酵條件為：磷尾礦用量10%、菌液接種量15%、菌種配比(PSF7∶PSB3)1∶2。3個因素分別依照1.3、1.4中的配比和設計取值，計算固態(tài)發(fā)酵堆體的有效磷含量。

1.8 響應面設計試驗

根據(jù)單因素試驗結果，確定影響固態(tài)發(fā)酵過程中有效磷含量的主要因素和最佳水平范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計試驗。以磷尾礦用量、菌液接種量和菌種配比(PSF7∶PSB3)3個因素為自變量，固態(tài)發(fā)酵過程中有效磷含量為響應值，設計3因素、3水平共17 個試驗點的響應面設計試驗，其中12個為析因試驗，5個為中心試驗，其因素與水平選取見表1。

表1 響應面設計試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface design experiment

1.9 堆肥發(fā)酵過程中有效磷含量的變化

將醬香型白酒酒糟、磷尾礦粉、復合菌液按照響應面設計試驗確定的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵驗證試驗，每隔24 h測定發(fā)酵樣品中的有效磷含量，發(fā)酵7 d，以不接種復合菌液作為空白對照，每組設置3個平行試驗。

2 結果與分析

2.1 磷含量標準曲線的繪制

以磷標準含量為橫坐標，吸光度OD700nm值為縱坐標，繪制磷含量標準曲線(圖1)，標準曲線方程為y=0.500 4x-0.007 3，決定系數(shù)(R2)=0.999 3。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 磷尾礦用量對有效磷含量的影響 由圖2可知，隨著磷尾礦用量的增加，有效磷含量快速增加，當磷尾礦用量為10%時，有效磷含量達到最高，隨后開始急劇下降。張永奎等[25]在細菌產(chǎn)酸分解磷礦的試驗中發(fā)現(xiàn)，磷礦分解過程中產(chǎn)生的氟離子會抑制細菌的活性，所以發(fā)酵體系中磷礦粉含量過高時，溶磷菌的溶磷活性大幅度降低。另外，有研究表明，微生物解磷能力受自身代謝產(chǎn)生的有機酸種類和數(shù)量的影響[2]。解磷微生物分泌的有機酸使難溶性磷溶解，但當難溶性磷含量過高時，反而對微生物解磷過程產(chǎn)生抑制作用，通過影響解磷微生物有機酸的分泌或干擾酶的活性，使得發(fā)酵過程中有效磷含量下降[26]。因此，可以初步確定磷尾礦和醬香型白酒酒糟固態(tài)發(fā)酵的最佳磷尾礦用量為10%。

圖1 磷含量標準曲線Fig.1 The standard curve of phosphorus content

圖2 磷尾礦用量對有效磷含量的影響Fig.2 Effect of phosphorus tailings amount on available phosphorus content

2.2.2 菌液接種量對有效磷含量的影響 由圖3可知，隨著菌液接種量的增加，有效磷含量先增加后逐漸下降，當菌液接種量為15%時，有效磷含量達到最高，為2 898.65 mg/kg。一方面是因為菌液接種量的不斷增加可促進發(fā)酵過程中解磷微生物生物量的積累，在解磷微生物的代謝作用下將難溶性磷進行生物轉化，使得有效磷含量不斷升高。但是當菌液接種量大于15%后，有效磷含量逐漸下降。一方面是因為磷作為核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷(ATP)、輔酶等的組成成分，在微生物生長過程中起著重要作用。復合菌液體系中的微生物為完成自身繁殖和代謝，將已轉化的有效磷用于自身代謝；另一方面，隨著菌液接種量增加，微生物所需營養(yǎng)達到、甚至超過發(fā)酵體系所能供應的最大營養(yǎng)負荷，造成解磷微生物生長變慢[27]，最終導致對難溶性磷的轉化能力下降。因此，可以初步確定磷尾礦和醬香型白酒酒糟固態(tài)發(fā)酵的最佳菌液接種量為15%。

圖3 菌液接種量對有效磷含量的影響Fig.3 Effect of inoculation amount of bacterial liquid on available phosphorus content

2.2.3 菌種配比(PSF7∶PSB3)對有效磷含量的影響 由圖4可知，隨著復合菌液中菌株PSB3比例的減少、菌株PSF7比例的增加，有效磷含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當菌種配比(PSF7∶PSB3)為2∶1 時，有效磷含量達到最高，為2 998.56 mg/kg。這是因為在固態(tài)發(fā)酵過程中，解磷真菌PSF7的解磷效果要優(yōu)于解磷細菌PSB3，與前人的研究結果一致[28-29]。林啟美等[28]在研究細菌和真菌的解磷能力及機制時發(fā)現(xiàn)，所選4株細菌培養(yǎng)6 d后，其解磷量最高，為43.34 mg/L；而相同條件下真菌較細菌表現(xiàn)出更高的解磷能力，真菌的解磷量最高可達145.36 mg/L。趙小蓉等[30]在進行4株細菌、4株真菌對不同難溶性磷酸鹽溶解能力的研究時發(fā)現(xiàn)，供試真菌的溶磷量是細菌的幾倍、甚至上百倍。本試驗中，當解磷真菌PSF7含量繼續(xù)增多時，有效磷含量卻出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為各類微生物之間存在著競爭或拮抗關系；還可能是因為真菌固化可溶性磷用于組建細胞的需求量大于細菌，即真菌生物體含磷量大于細菌，但大部分研究僅考慮上清液中有效磷含量，而將生物體含磷量忽略不計，從而導致總體解磷量的估算偏低。因此，可以初步確定磷尾礦和醬香型白酒酒糟固態(tài)發(fā)酵的最佳菌種配比(PSF7∶PSB3)為2∶1。

圖4 菌種配比(PSF7∶PSB3)對有效磷含量的影響Fig.4 Effect of the ratio of strain(PSF7∶PSB3)on available phosphorus content

2.3 響應面設計試驗結果

2.3.1 響應面回歸模型的建立與顯著性檢驗 響應面試驗中心組合試驗設計及結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2的數(shù)據(jù)進行多元擬合，得到各因素與響應值的二次多項式方程模型：

y=3 038.60-136.95A+102.45B+52.45C-48.93AB-186.84AC+4.00BC-205.89A2-110.87B2-178.84C2，其中y為有效磷含量。

模型中A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2對有效磷含量有極顯著影響，BC對有效磷含量影響不顯著，說明磷尾礦用量、菌液接種量、菌種配比(PSF7∶PSB3)

都是磷尾礦和醬香型白酒酒糟固態(tài)解磷過程中的重要影響因素。由F值大小可知，各因素影響大小依次為A>B>C。

表2 響應面中心組合試驗設計及結果Tab.2 Design and results of response surface central composite experiment

2.3.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化 通過Design-Expert 8.0.6 軟件繪制響應面曲線，進一步研究相關變量之間的交互作用，圖5表示試驗水平范圍內，磷尾礦用量、菌液接種量、菌種配比(PSE7∶PSB3)這3個因素中任意1個變量取定值時，其余2個變量對堆體中有效磷含量的影響。每個交互作用都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，從各圖的變化幅度及等高線可以看出，AB和AC有極顯著交互作用，BC的交互作用不顯著。

表3 響應面回歸模型方差分析Tab.3 The analysis of variance for response surface regression model

注：**表示差異極顯著。

Note：**indicates extremely significant differences.

圖5 磷尾礦用量、菌液接種量和菌種配比對有效磷含量影響的響應面曲線Fig.5 Response surface curve for the effects of inoculation amount of bacterial liquid,the ratio of strain,phosphorus tailings amount on content of available phosphorus

2.3.3 最優(yōu)條件的確定及模型驗證 利用Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到磷尾礦和醬香型白酒酒糟堆肥發(fā)酵的最優(yōu)條件為磷尾礦用量6.89%、菌液接種量18.04%、菌種配比(PSF7∶PSB3)2.3∶1。在此條件下，預測堆體中有效磷含量的最大值為3 124.86 mg/kg。按上述優(yōu)化工藝參數(shù)進行3次平行試驗，驗證響應面分析的可靠性，實際測得堆體中有效磷含量的平均值為3 108.05 mg/kg，與理論值3 124.86 mg/kg相比相差僅為0.54%。因此，此模型在本試驗范圍內科學合理，采用響應面設計試驗優(yōu)化得到的堆肥解磷條件參數(shù)是可行有效的。

2.3.4 固態(tài)發(fā)酵過程中有效磷含量的變化 如圖6所示，在整個堆肥解磷過程中，試驗組有效磷含量遠遠高于空白。試驗組有效磷含量先增加后略有下降，而空白有效磷含量初期有所增加，但在3 d后保持穩(wěn)定。在第3天時，試驗組中有效磷含量達到最高，為3 108.05 mg/kg，空白有效磷含量達到最高，為1 746.40 mg/kg，試驗組有效磷含量是空白的1.78倍。由此說明，上述最佳堆肥工藝條件能有效地提高有效磷含量。

圖6 堆肥發(fā)酵過程中有效磷含量的變化Fig.6 Change of content of available phosphorus in compost fermentation process

3 結論與討論

單因素試驗結果表明，有效磷含量分別在磷尾礦用量為10%、接種量為15%、菌種配比(PSF7∶PSB3)(體積比)為2∶1時達到最高。Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到磷尾礦和醬香型白酒酒糟堆肥最佳條件為磷尾礦用量6.89%、菌液接種量18.04%、菌種配比(PSF7∶PSB3)2.3∶1。由響應面設計試驗可知，磷尾礦用量、菌液接種量、菌種配比(PSF7∶PSB3)3個因素及其交互項，除菌液接種量和菌種配比(PSF7∶PSB3)交互項外，都達到極顯著水平(P<0.000 1)。3個因素對解磷量的影響大小依次為磷尾礦用量>菌液接種量>菌種配比(PSF7∶PSB3)，各因素不同組合的解磷效果差異較顯著。在最優(yōu)條件下，堆體中有效磷含量為3 108.05 mg/kg，相比前人解磷條件優(yōu)化的研究[31]，解磷效果較好，且與理論值3 124.86 mg/kg相差僅為0.54%，說明響應面設計試驗可以有效構建模型來達到優(yōu)化解磷條件的目的。當發(fā)酵第3天時，接種的試驗組中有效磷含量是未接種空白的1.78倍，說明上述最佳堆肥工藝能有效地提高有效磷含量。

通過單因素試驗探究各因素對有效磷含量的影響，隨著磷尾礦用量和菌液接種量的增加，有效磷含量都呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。是否因為磷尾礦用量的不斷增加而產(chǎn)生的氟離子對微生物產(chǎn)生毒害作用，還需要進一步試驗驗證。合理的菌種配比(PSF7∶PSB3)可以有效提高有效磷含量，解磷真菌PSF7的解磷效果要優(yōu)于解磷細菌PSB3，但是2個菌株之間是否有相互促進作用，復合菌劑解磷量是否高于各單株菌還需繼續(xù)探究，菌株之間復雜的競爭、協(xié)同、拮抗關系還有待研究。

據(jù)估計，若我國微生物肥料產(chǎn)量占化肥產(chǎn)量的3%，則糧食產(chǎn)量可顯著增加[32-37]。但是，基于解磷微生物種類繁多、不同菌株之間溶磷能力差異大、真菌分泌的有機酸種類復雜[38]等因素的影響，生物有機磷肥在我國推廣應用并不普遍。土壤是國家重要的自然資源，而土壤基礎地力又直接影響作物產(chǎn)量。近年來，隨著民眾對環(huán)境問題和土壤循環(huán)利用認知的提高，生物有機磷肥的研發(fā)受到了高度重視，這也將成為未來高效環(huán)保肥料行業(yè)的重要突破口。