包哈申 胡斯楞

【摘要】目的 探討不同劑量粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)急性心肌梗死后BCL-XL表達(dá)的影響。方法 腹腔注射異丙腎上腺素誘小鼠AMI模型，分為AMI組、AMI+G-CSF中劑量組、AMI+G-CSF高劑量組及正常對(duì)照組。分別于造模后第1、14、28天斷頸法處死小鼠取出心臟，行心肌BCL-XL免疫組化。結(jié)果 BCL-XL蛋白以心肌細(xì)胞胞漿表達(dá)為主，BCL-XL平均光密度造模后第1天較對(duì)照組顯著上升（P<0.05）。中劑量組BCL-XL平均光密度顯著大于高劑量組（P<0.05）。結(jié)論 G-CSF可顯著抑制AMI后心肌細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性。

【關(guān)鍵詞】G-CSF；急性心肌梗死；BCL-XL

【中圖分類號(hào)】R541.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2019.13..02

Effects of Granulocyte-colony stimulating factor on post myocardial infraction BCL-XL expression

BAO Ha-shen，HU Si-leng

（Xilin Gol League Hospital，Inner Mongolia Xilin Hot 026000，china）

【Abstract】Objective To investigate the effect of different doses of granulocyte colony-stimulating factor on the expression of BCL-XL after acute myocardial infarction.Methods Mice with AMI induced by intraperitoneal injection of isoproterenol were divided into three groups：AMI group，mid-dose group of AMI+G-CSF，high-dose group of AMI+G-CSF and normal control group.On the 1st， 14th and 28th day after the model was established， the mice were killed by neck amputation and their hearts were taken out for BCL-XL immunohistochemistry.Results BCL-XL protein was mainly expressed in the cytoplasm of myocardial cells. The average optical density of BCL-XL increased significantly on the first day after modeling compared with the control group （P<0.05）. The average optical density of BCL-XL in middle dose group was significantly higher than that in high dose group （P<0.05）.Conclusion G-CSF can significantly inhibit cardiomyocyte apoptosis after AMI in a dose-dependent manner.

【Key words】G-CSF；Acute myocardial infraction；BCL-XL

細(xì)胞凋亡是指由基因控制的自主的、有序的、主動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控。急性心肌梗死后不僅因缺血壞死而喪失大量的心肌細(xì)胞，細(xì)胞凋亡也同樣造成大量心肌細(xì)胞的丟失[1]。有研究報(bào)道在AMI模型大鼠，心肌細(xì)胞凋亡與缺血壞死比例可高達(dá)30：1，大量功能正常的心肌細(xì)胞凋亡可造成心臟收縮功能減退、心室壁變薄、心室擴(kuò)張等病理性改變而加速心肌梗死后心室重構(gòu)的進(jìn)展[2]。本研究旨在探討G-CSF對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明種小鼠150只，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。鹽酸異丙腎上腺素（東京化成工業(yè)株式會(huì)社），人重組粒細(xì)胞刺激因子注射液（北京四環(huán)生物制藥），兔TGF-β1多克隆抗體（protein tech公司），

Kit-9710即用型免疫組化試劑盒（福州邁新），DAB顯色試劑盒（福州邁新生），磷酸鹽緩沖液，MD4000 B LED顯微鏡（Lecia公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模

鹽酸異丙腎上腺素85 mg/kg連續(xù)腹腔注射3天誘導(dǎo)AMI模型。造模后第1天10%水合氯醛4.5 ml/kg腹腔注射麻醉小鼠，采集Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以J點(diǎn)顯著上抬作為初步判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，以J點(diǎn)上臺(tái)<0.2 mV作為排除標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取心電圖符合上述標(biāo)準(zhǔn)的模型動(dòng)物10只，行心肌HE染色觀察心肌組織結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步判斷造模是否成功。

1.2.2 分組

將模型小鼠隨機(jī)分成A、B、C三組，再取10只正常小鼠作為D組。A組：AMI組，30只；B組：AMI+G-CSF中劑量組，G-CSF 50 ug/kg連續(xù)腹腔注射5天，20只；C組：AMI+G-CSF高劑量組，G-CSF 100 ug/kg連續(xù)腹腔注射5天，20只；D組：對(duì)照組，10只。A組分別于造模后第1、14、28天采血并各處死三分之一，B、C組分別于造模后第14、28天采血并各處死一半。

1.2.3 血清學(xué)檢測(cè)

斷頸法處死小鼠，迅速打開胸腔取出心臟，置于10%福爾馬林液固定24小時(shí)以上，行心肌BCL-XL免疫組化。光學(xué)顯微鏡下觀察BCL-XL的表達(dá)量及分布況，每只小鼠每組免疫組化在相同的顯微鏡參數(shù)下隨機(jī)采集3張圖片，采用Image pro plus 6.0圖像軟件計(jì)算BCL-XL的平均光密度，并進(jìn)行組內(nèi)及組間對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與D組相比較，造模后第1天A組BCL-XL平均光密度顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

第14天時(shí)，與A組第1天比較A、B、C三組BCL-XL平均光密度均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A、B、C三組間比較，BCL-XL平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

第28天時(shí)，與第14天比較A、B兩組BCL-XL平均光密度均顯著地上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而C組BCL-XL平均光密度輕度下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。A、B、C三組間比較，A組BCL-XL平均光密度均顯著大于B組與C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），B組BCL-XL平均光密度均顯著大于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討 論

李陶等 [3]對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行了深入的研究，并報(bào)道大鼠AMI模型誘導(dǎo)后第1天AMI組心肌細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡主要分布在梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)，而遠(yuǎn)端非梗死區(qū)只占7%。隨著時(shí)間的推移遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡占主導(dǎo)地位，4周后其分布率達(dá)54%，心肌細(xì)胞凋亡率也由4周前的（0.07±0.03）%上升至（0.09±0.05）%，遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率與左心室舒張末徑之間存在正相關(guān)性，認(rèn)為遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋是心肌梗死后心室重構(gòu)及心功能惡化的重要原因之一。遠(yuǎn)端非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡主要與心肌細(xì)胞牽張力及壓力負(fù)荷增高、炎性細(xì)胞因子的釋放、神經(jīng)體液機(jī)制的激活等有關(guān)，其中AngⅡ也參與了心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡過程。田翠等 [4]研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ與心肌細(xì)胞AT1結(jié)合開放電壓依賴性L型鈣通道，促使大量鈣離子內(nèi)流激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶，鈣依賴性核酸內(nèi)切酶切割心肌細(xì)胞DNA雙鏈導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。

本研究未直接觀察心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡情況，而是通過抗凋亡蛋白BCL-XL在心肌中的表達(dá)量來間接反映了心肌細(xì)胞凋亡情況。崔巍等[5]在結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后觀察到抗凋亡蛋白BCL-XL表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高，并認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌缺血的早期病理改變，心肌急性缺血時(shí)抗凋亡蛋白BCL-XL表達(dá)量迅速增高以對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)同樣也觀察到了造模后第1天AMI組心肌BCL-XL蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著升高，提示AMI后早期就有大量心肌細(xì)胞凋亡。第28天AMI組

BCL-XL蛋白表達(dá)量再次升高，可能與AMI晚期非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡增高有關(guān)，表明AMI后心肌細(xì)胞凋亡持續(xù)存在，而過量表達(dá)的抗凋亡蛋白BCL-XL被凋亡蛋白Caspase降解成有促凋亡作用的片段，可能會(huì)進(jìn)一步加重AMI晚期心肌細(xì)胞凋亡。值得注意的是，G-CSF抑制心室重構(gòu)、改善心功能的作用機(jī)制與G-CSF通過激活Jak/Stat3信號(hào)通路調(diào)控抗凋亡蛋白BCL-XL、BCL-2與凋亡蛋白Bad、Bax之間的相互作用，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。G-CSF干預(yù)后高劑量給藥組BCL-XL表達(dá)量持續(xù)下降，而中劑量給藥組BCL-XL表達(dá)量造模后第28天與造模后第14天比較有所上升，但仍低于AMI組，第28天G-CSF高劑量給藥組BCL-XL表達(dá)量顯著低于G-CSF中劑量給藥組，提示G-CSF高劑量組抑制心肌梗死后晚期心肌細(xì)胞凋亡作用可能優(yōu)于G-CSF中劑量組。綜上所述心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死后心室重構(gòu)的重要組部分，G-CSF干預(yù)可顯著而持久的抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡斯楞，魏芳晶.G-CSF和IGF-1抑制病理性心室重構(gòu)及改善心功能的作用機(jī)制[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（23）：4269-4272.

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[3] 李 陶，史洪濤，王 翔，等.犬急性心肌缺血后左心室功能與抑凋亡蛋白Bcl-xl表達(dá)的研究[J].臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志，2007，07：

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[4] 田 翠，來 松，徐多嬌，侯翠柳，劉 洋，王紅霞，楊 慧.小鼠心肌缺血/再灌注損傷中TTC染色方法的改進(jìn)及蛋白酶體作用機(jī)制的探討[J].心肺血管病雜志，2018，37（01）：14-18.

[5] 崔 巍，李玉琳，王吉靜，張聰聰，吳依娜.細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在心肌細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用[J].心肺血管病雜志，2013，32（06）：768-772.

本文編輯：劉欣悅