汪晶晶，王蔚然，董穎，李彬，李潔，白婧，劉傳斌，林琨，陳韻岱，李泱

(解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科，北京 100853)

心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)最常見(jiàn)原因是惡性室性心律失常，其與慢性心力衰竭有非常緊密的關(guān)系。Framingham研究顯示，心力衰竭患者猝死率是普通人群的6～9倍[1]。心力衰竭時(shí)心肌發(fā)生顯著的電重構(gòu)，在長(zhǎng)期病理學(xué)因素作用下，心肌電活動(dòng)出現(xiàn)多種形式的適應(yīng)性改變，這在一定程度上能代償和緩解心功能損害，但同時(shí)也成為致心律失常的因素[2]。已有研究證實(shí)，心力衰竭后遲后除極(delayed afterdepolarization,DAD)及其引起的觸發(fā)活動(dòng)(triggered activity,TA)在SCD發(fā)生中起著重要的作用[3]。大蒜素(allicin,All)是一種從大蒜鱗莖中分離提取的有效成分，是具有多種生物學(xué)活性的化合物。研究發(fā)現(xiàn)，All對(duì)多種離子流均有作用，可發(fā)揮抗心律失常的效應(yīng)。我們的前期研究顯示，All可減少原發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞和心力衰竭后心室肌細(xì)胞上的L型鈣通道電流(L-type calcium current,ICa,L)[4-7]。但尚不可知其是否對(duì)心力衰竭后細(xì)胞內(nèi)鈣離子及DAD有作用，并進(jìn)而引起TA。本文選擇心力衰竭大鼠的心室肌細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察All對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞DAD和TA發(fā)生的影響，進(jìn)一步探討其可能的離子流機(jī)制，旨在尋找新的治療心力衰竭后抗惡性心律失常的藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半。膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶、FBS胎牛血清、HEPES緩沖液、L-谷氨酸、4-氨基吡啶 (4-aminopyridine,4AP)、河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)和CsCl購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；依他酸(Egtazic acid,EGTA)購(gòu)自美國(guó)Fluka Biochemika公司。All購(gòu)自索萊寶試劑公司。細(xì)胞分離液(mmol/L)：CaCl21.5，KCl 5，NaCl 110.0，MgCl21.2，HEPES緩沖液10，葡萄糖10，pH值用NaOH調(diào)至7.4；無(wú)鈣分離液為分離液中不加CaCl2但增加EGTA 10 mmol/L。細(xì)胞外液：同細(xì)胞分離液，為排除干擾電流，加入5 mmol/L的4AP阻斷瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward potassium current,Ito)，加入100 μmol/L的TTX阻斷鈉通道電流(INa)。細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L)：氯化四乙基銨(tetraethylammonium chloride,TEA-Cl)20、CsCl 100、EGTA 10、Na2ATP 5、HEPES緩沖液10，pH調(diào)至7.2。KB液(mmol/L)：L-谷氨酸50，KCl 30，KOH 80，KH2PO430，?；撬?20，HEPES 10，葡萄糖10，MgSO43，EGTA 0.5，KOH調(diào)pH值至7.4。

1.2 方法

1.2.1 心力衰竭模型制作 參考文獻(xiàn)[8]采用腹主動(dòng)脈結(jié)扎法選取SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半。10%水合氯醛腹腔麻醉，于劍突下腹正中切口，分層打開(kāi)腹腔，在腎動(dòng)脈分支上方0.5 cm處鈍性游離腹主動(dòng)脈，將8號(hào)注射器針頭磨鈍平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和注射器針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器針頭撤出，關(guān)腹，分層縫合(模型組)。另外取10只SD大鼠，除不結(jié)扎之外，其他步驟與模型組相同(假手術(shù)組)。2組大鼠于術(shù)后予青霉素4萬(wàn)U每只，腹腔注射6 d，預(yù)防感染。飼養(yǎng)至8周。

1.2.2 大鼠心室肌細(xì)胞的分離 采用改進(jìn)的酶解法制備大鼠心室肌單細(xì)胞。每組大鼠首先肝素化(腹腔注射100 IU/ml)，用20%烏拉坦(1.00 mg/kg)麻醉，后迅速取其心臟，在37℃和通氧條件下行Langendorff灌流：用無(wú)Ca2+Tyrode′s液灌流3～5 min，用含膠原酶Ⅱ 70 mg、胰蛋白酶12 mg的無(wú)Ca2+Tyrode′s液(50 ml)灌流20～25 min。沿房室間溝取心室肌，剪碎入KB液中并吹打使細(xì)胞脫落，-4℃保存，1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組 37℃環(huán)境下，取模型組細(xì)胞保存液加于1 ml灌流槽中，待細(xì)胞貼壁后，給予200.0 μmol/L終濃度的All，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無(wú)顆粒、橫紋清晰、無(wú)收縮的心室肌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)(給藥組)。其給藥方式為：將All用二甲基亞砜溶解，并制備成儲(chǔ)備液，細(xì)胞外液稀釋成200.0 μmol/L終濃度；采用局部灌流裝置于細(xì)胞外恒流灌流方式對(duì)給藥組進(jìn)行給藥，為確保藥物效應(yīng)的一致性，待平衡5 min后方可記錄電流[7]。同樣取模型組細(xì)胞(不給藥，心力衰竭組)或假手術(shù)組細(xì)胞(對(duì)照組)加于灌流槽中，除不加藥外，其余步驟均與給藥組一致。根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)不同，分別選取不同個(gè)數(shù)細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.2.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄 數(shù)據(jù)記錄采用軟件(pCLAMP 10.2)。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制下記錄電流。將Axon-700B膜片鉗放大器(Sunnyvale,美國(guó))同計(jì)算機(jī)連接，刺激信號(hào)及電壓輸入信號(hào)應(yīng)用Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Sunnyvale,美國(guó))收集。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀(Narishige公司，日本)拉制成電阻為2.0～5.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進(jìn)行封接，使封接電阻達(dá)1 GΩ以上，吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。測(cè)定電容時(shí)，施以0.4 V/s的斜坡刺激，按方程Cm=I/(dV/dt)計(jì)算(Cm為膜電容，I為電流值，dV/dt即電壓斜率)。為消除細(xì)胞間的誤差，I值以電流密度(pA/pF)表示。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5 kHz。串聯(lián)電阻補(bǔ)償90%～95%以消除電壓偏差，液接電位補(bǔ)償校正至<2 mV，慢電容補(bǔ)償約為85%～90%，以消除膜電容的充放電影響。

1.2.5 指標(biāo)檢測(cè)及參數(shù)設(shè)置 (1)DAD和TA。電流鉗模式下，鉗制電位0 mV，1 500 pA持續(xù)10 ms的20個(gè)串刺激，頻率4.0 Hz，記錄動(dòng)作電位。DAD被定義為在4期緊接著正常動(dòng)作電位后出現(xiàn)的去極化幅值>5 mV、持續(xù)時(shí)間>10 ms的自動(dòng)去極化波形；TA被定義為在DAD的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的一個(gè)自發(fā)性動(dòng)作電位，其特征是0相有明顯自發(fā)性除極[9]。(2)ICa,L電流及門(mén)控機(jī)制。穩(wěn)態(tài)激活曲線：保持電位-40 mV，施予150 ms，階躍10 mV，-40 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，記錄ICa,L和ICa,L,max。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)激活曲線(電流-電壓圖)。穩(wěn)態(tài)失活曲線：保持電位-40 mV，施予500 ms，階躍10 mV，-70 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至0 mV，150 ms的測(cè)試脈沖，記錄ICa,L和ICa,L,max，用Boltzmann方程ICa/ICa,max=1/{1+exp[(Vm-V1/2)/k]}擬合求半數(shù)失活電壓V1/2inact。(3)瞬時(shí)內(nèi)向電流(transient inward current,Iti)。在電壓鉗方式下，給予20個(gè)方波預(yù)刺激，-80 mV～+50 mV，150 ms，每組刺激間隔100 ms，之后給予2 000 ms、-100 mV～+200 mV的測(cè)試刺激，引出Iti。Iti被定義為：波峰與電流基線之間的差值，按第一個(gè)出現(xiàn)的波形進(jìn)行分析。(4)Na+/Ca+交換電流(Na+/Ca+exchange current,INCX)。在電壓鉗方式下，采用斜坡刺激的模式引出INCX電流。鉗制電位為-60 mV，去極化至+80 mV，持續(xù)400 ms，以90 V/s的速率復(fù)極并超極化至-120 mV，此后恢復(fù)到-60 mV。(5)鈣瞬變。取急性分離好的心室肌細(xì)胞500 μl于新的試管中，應(yīng)用BSA混懸液稀釋至1 ml，加入Fluo 4-AM鈣熒光染料(1∶500稀釋)，水平搖床上反應(yīng)20 min。試管中加入臺(tái)式液至8 ml，離心機(jī)10 000轉(zhuǎn)/min離心20～200 s，傾去上清液，應(yīng)用BSA混懸液重懸細(xì)胞。取100 μl染色的心室肌細(xì)胞懸液加入備好的共聚焦小皿中，靜置1 h，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，將共聚焦小皿放置共聚焦顯微鏡上，刺激電極放置共聚焦小皿中，沒(méi)入臺(tái)式液，給予不同頻率刺激，觀察鈣瞬變和鈣離子濃度等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心室肌細(xì)胞DAD和TA發(fā)生率比較

每組選取15個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組、心力衰竭組及給藥組細(xì)胞上DAD和TA發(fā)生率依次為[13.3%(2/15),0.0%(0/15)]、[60.0%(9/15)，26.7%(4/15)]和[40.0%(6/15)，13.3%(2/15)]。與對(duì)照組比較，心力衰竭組細(xì)胞DAD和TA發(fā)生率顯著增加；與心力衰竭組比較，給藥組細(xì)胞上DAD和TA發(fā)生率顯著下降，下降幅度分別為20.0%和13.4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖1)。說(shuō)明All對(duì)心力衰竭大鼠心室肌細(xì)胞的DAD和TA均有一定抑制效應(yīng)。

2.2 3組大鼠心室肌細(xì)胞ICa,L變化比較

每組選取15個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察。與對(duì)照組比較，心力衰竭組細(xì)胞膜上的ICa,L密度顯著增大；與心力衰竭組比較，給藥組ICa,L密度顯著減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖2A，B)。在刺激電位為0 mV時(shí)，與對(duì)照組(-11.5±0.4)pA/pF比較,心力衰竭組細(xì)胞ICa,L的電流密度增加至(-17.2±0.9)pA/pF；與心力衰竭組比較，給藥組細(xì)胞電流密度則降低為(-13.5±1.0)pA/pF，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖2C)。但3組穩(wěn)態(tài)激活曲線比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組[(-26.5±3.9)mV]比較，心力衰竭組細(xì)胞鈣電流的V1/2,inact移向更正的電位為(-7.2±1.9)mV(P<0.01)；與心力衰竭組比較，給藥組細(xì)胞鈣電流的V1/2,inact恢復(fù)至(-18.5±2.5)mV(P<0.01)。且3組穩(wěn)態(tài)失活曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖2D)。以上結(jié)果提示心力衰竭時(shí)鈣電流增加，主要可能通過(guò)穩(wěn)態(tài)失活曲線向去極化電位移動(dòng)，導(dǎo)致相同電位刺激時(shí)通道失活速率減慢，而應(yīng)用All可以抑制此現(xiàn)象。

圖1 3組大鼠心室肌細(xì)胞DAD和TA發(fā)生率比較Figure 1 Effects of allicin on DAD and TA in ventricular myocytes of heart failure ratsA:the original recording diagram of DAD and TA in ventricular myocytes;B:histogram of DAD incidence;C:histogram of TA incidence. Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin;DAD:delayed afterdepolarization;TA:triggered activity. Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖2 3組大鼠心室肌細(xì)胞ICa,L變化比較Figure 2 Comparison of ICa,L in ventricular myocytes among three groupsA:original recording diagram of peak calcium current in ventricular myocytes;B:changes in peak ICa,L density;C:current-voltage curve of ICa,L; D:homeostasis inactivation curve of ICa,L.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01; compared with heart failure group,##P<0.01.

2.3 3組大鼠心室肌細(xì)胞Iti變化比較

每組選取10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察。與對(duì)照組比較，心力衰竭組細(xì)胞Iti電流密度顯著增加；與心力衰竭組比較，給藥組細(xì)胞Iti電流密度又顯著下降(P<0.01；圖3A，B)。電流-電壓圖(圖3C)顯示，在-50 mV去極化時(shí)，對(duì)照組的內(nèi)向峰電流密度為(-0.23±0.01)pA/pF，而心力衰竭組細(xì)胞顯著增加至(-1.05±0.06)pA/pF；與心力衰竭組比較，給藥組則又顯著降低為(-0.53±0.05)pA/pF，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Iti電流在-50 mV去極化時(shí)最大，在更負(fù)或更正的刺激電位時(shí)，電流幅值均減少。其中心力衰竭組電流密度在-90 mV～+10 mV刺激下增加最為明顯，而在+20 mV以上電位刺激時(shí)，Iti呈現(xiàn)出外向電流特征。

2.4 3組大鼠心室肌細(xì)胞INCX變化比較

每組選取10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察。INCX分為內(nèi)向(順向)和外向(逆向)電流。其中內(nèi)向電流為3個(gè)鈉離子內(nèi)流及一個(gè)鈣離子外排所致，外向電流反之。與對(duì)照組比較，心力衰竭組內(nèi)向電流密度從(-3.2±0.1)pA/pF顯著增加至(-5.8±0.7)pA/pF(P<0.01)；而與心力衰竭組比較，給藥組電流密度則顯著恢復(fù)至(-4.2±0.4)pA/pF(P<0.01；圖4)。外相電流變化不大。

2.5 3組大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變和鈣離子濃度比較

每組選取15個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察。與對(duì)照組比較，心力衰竭組細(xì)胞靜息態(tài)鈣濃度、鈣瞬變幅度和胞內(nèi)鈣峰值50%的時(shí)間等參數(shù)顯著升高(P<0.01)；與心力衰竭組比較，上述參數(shù)在給藥組細(xì)胞中均顯著降低(P<0.01；圖5A，B，圖6A，B，C)。心力衰竭后大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變衰減率與對(duì)照組比較顯著下降，而應(yīng)用All后，得到顯著恢復(fù)(P<0.05；圖6D)。

圖3 3組大鼠心室肌細(xì)胞Iti變化比較Figure 3 Comparison of Iti in ventricular myocytes among three groupsA:original recording diagram of Iti in ventricular myocytes;B:changes in peak Iti density;C:current-voltage curve of Iti.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖4 3組大鼠心室肌細(xì)胞INCX變化比較Figure 4 Comparison of INCX in ventricular myocytes among three groupsA:original recording of INCX in ventricular myocytes;B:changes in peak INCX density.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin. Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖5 3組大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的比較Figure 5 Comparison of calcium concentration in ventricular myocytes among three groupsA:fluorescence image of the calcium ions in ventricular myocytes;B:intracellular calcium ion concentration in resting state.Ctrl:control group; HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,##P<0.01.

圖6 3組大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的比較Figure 6 Comparison of intracellular calcium transients in ventricular myocytes among 3 groupsA:intracellular calcium waves change of ventricular myocytes in 3 groups;B:cell calcium transient amplitude changes;C:transient time of 50% peak calcium;D:changes in the transient decay rate of calcium.Ctrl:control group;HF:heart failure group;All:allicin.Compared with control group,**P<0.01;compared with heart failure group,#P<0.05,##P<0.01.

3 討 論

心力衰竭致心律失常作用是電重構(gòu)的不良后果，心力衰竭除心功能不全引起的血流動(dòng)力學(xué)障礙外，還因心臟電重構(gòu)引發(fā)惡性心律失常導(dǎo)致猝死。而心力衰竭后觸發(fā)性心律失常則是猝死的主要原因[10,11]。本研究顯示，All可以降低心力衰竭時(shí)心室細(xì)胞DAD和由此引起的觸發(fā)性心律失常的發(fā)生，使其分別降低20.0%和13.4%，這可能為心力衰竭后心律失常的防治提供新的潛在藥物。

竇房結(jié)的沖動(dòng)產(chǎn)生動(dòng)作電位使整個(gè)心臟出現(xiàn)節(jié)律性搏動(dòng)。每一動(dòng)作電位末期常伴有一個(gè)緩慢的除極波。正常情況下，該波隨動(dòng)作電位的恢復(fù)而消失。心力衰竭時(shí)，其可增大或產(chǎn)生若干除極波，即DAD或振蕩后電位，該電位增高達(dá)到閾值時(shí)，則發(fā)出新的動(dòng)作電位，從而形成期前收縮，如此產(chǎn)生連續(xù)沖動(dòng)，則形成心動(dòng)過(guò)速，產(chǎn)生TA而導(dǎo)致觸發(fā)性心律失常[12]。DAD是誘發(fā)觸發(fā)性心律失常的主要原因之一，其發(fā)生在4相復(fù)極后，主要由Iti引起。Iti電流的載流離子主要是鈣離子和鈉離子，直接受INCX和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控，也有少部分受鈣激活氯電流(ICl,Ca)和非選擇性陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)電流(Isus)的影響[13-15]。其中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載起著關(guān)鍵性作用，故凡是引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的因素都可促發(fā)這一離子流，從而產(chǎn)生DAD或TA。反之，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，降低Iti電流，則可減少DAD和TA的發(fā)生[16,17]。本研究結(jié)果顯示，All可減少心力衰竭時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變，降低鈉鈣交換體內(nèi)向電流的增加，直接或間接降低Iti電流，特別是內(nèi)向電流的增加，同時(shí)緩解ICa,L的升高。因此，All通過(guò)抑制多個(gè)離子流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的改變，減少了心力衰竭DAD及由此引發(fā)的TA的發(fā)生，為緩解心力衰竭時(shí)SCD的干預(yù)提供了可能，也為該藥物的研發(fā)提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

然而，All是否影響參與心力衰竭時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子改變的蛋白尚未可知，也無(wú)法得知其對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣作用的分子基礎(chǔ)，同時(shí)也未在整體動(dòng)物層面就All對(duì)心力衰竭后觸發(fā)性心律失常的效應(yīng)進(jìn)行探究，因此，本課題下一步工作需要對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探究。