牛春曉 高艷武 常婷 李柱一

重癥肌無力(MG)是由自身抗體介導、T細胞依賴、補體參與的自身免疫性疾病[1],CD4+輔助性T細胞亞群在MG發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2-3]。褪黑素是一種主要由松果體在夜間分泌的激素,除同步睡眠之外,還可執(zhí)行多種生理功能,包括抗氧化和免疫調(diào)節(jié)[4]。研究表明褪黑素可通過對T細胞的調(diào)節(jié)[5]多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)[6]、多發(fā)性硬化[5]中發(fā)揮保護性作用。目前者對褪黑素是否在MG中也發(fā)揮保護性作用的研究尚未見報道。本研究通過觀察MG患者血清褪黑素水平及褪黑素受體系統(tǒng)表達的變化,并分析其與MG病情嚴重程度的相關性,旨在初步探討褪黑素在MG中的可能作用。

1 對象和方法

1.1 對象(1)MG組:隨機收集2017年12月至2018年08月作者醫(yī)院收治的MG患者15例,均符合MG診斷標準。其中男5例、女10例,年齡14～85歲,平均(40.3±17.6)歲;病程1～17年,中位數(shù)3年,四分位數(shù)間距5年。15例MG患者中,合并胸腺瘤4例,其中2例接受胸腺瘤切除手術。3例為眼肌型,12例為全身型。服用免疫抑制劑者8例,未服用免疫抑制劑者7例。所有患者行肌無力相關抗體檢測,其中抗乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AChR-Ab)陽性者14例,抗肌肉特異性受體酪氨酸激酶(musclespecific receptor tyrosine kinase,MuSK)抗體陽性者1例。重復頻率電刺激檢測,14例患者出現(xiàn)多支神經(jīng)低頻遞減,1例未見異常。15例患者中僅1例合并其他自身免疫性疾病(甲狀腺功能亢進)。(2)對照組:選取與MG組年齡和性別相匹配的健康人15名作為對照組,其中男6名、女9名,年齡23～63歲,平均(40.4±13.8)歲。所有研究對象均簽署知情同意書,該研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 主要儀器和試劑10 m L肝素鈉抗凝管、抗人CD4-FITC抗體、破核膜液、FACS AriaⅡ流式細胞儀(美國BD公司),人淋巴細胞分離液(美國GE公司),人褪黑素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(中國Elabscience公司),抗人RORɑ-PE抗體(美國R&D公司),RIPA裂解液(中國碧云天公司),兔抗人 MT1抗體、兔抗人RORɑ抗體、鼠抗人βactin抗體(英國abcam公司),山羊抗兔Ig G二抗、山羊抗鼠IgG二抗(中國Servicebio公司)。

1.3 方法均于上午9:00至10:00使用10 m L肝素鈉抗凝管收集外周血,4℃靜置2 h后低溫1500r/min離心10 min,吸取上層淡黃色清亮血清,分裝至EP管,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 人外周血單個核細胞(PBMCs)分離及褪黑素受體檢測:去除血清的血液,加入等體積磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)混勻后,沿管壁緩慢平鋪到相同體積的人淋巴細胞分離液上層,利用密度梯度離心原理,將各種血液成分按密度分離。離心后分為三層,上層為血漿;下層為紅細胞與粒細胞;中間白膜層為PBMCs。將收集的PBMCs用PBS洗滌后分為兩部分,一部分轉移到流式管中,用于檢測褪黑素核受體系統(tǒng)表達,另一部分PBMCs用凍存液〔(90%Fetal Bovine Serum(FBS)+10%dimethyl sulfoxide(DMSO)〕重懸于凍存管中,-80℃保存,用于檢測褪黑素膜受體MT1及核受體RORɑ表達。

1.3.2 血清褪黑素水平檢測:取血清,按照人褪黑素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書操作步驟檢測血清褪黑素水平。

1.3.3 流式細胞術(FCM)檢測褪黑素核受體系統(tǒng)表達:將流式管中收集的PBMCs以1500r/min離心10 min后去上清,加入抗人CD4-FITC抗體5μL,4℃避光30 min,PBS洗滌后加入破核膜液1 m L,4℃避光45 min,用洗滌液2 m L洗滌2次,去上清,加入抗人RORɑ-PE抗體5μL,4℃避光40 min,洗滌2遍后用300μL PBS懸浮,上機檢測。使用Flowjo 7.6.1軟件分析流式檢測結果,根據(jù)前向散射光(forward scatter,FSC)和側向散射光(side scatter,SSC)圈出淋巴細胞,以SSC為縱坐標,CD4-FITC為橫坐標圈門,即可得到淋巴細胞中CD4+輔助T細胞比例;以RORɑ-PE為縱坐標,CD4-FITC為橫坐標圈門,第四象限表示CD4+RORɑ+細胞比例;由于CD4+RORɑ+細胞比例較低,選中第四象限,將縱坐標設為Histogram,統(tǒng)計學分析得到RORɑ+CD4+T細胞平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI),同理可以得到第三象限 RORɑ-CD4+T 細胞 MFI,計算 RORɑ+CD4+T細胞與RORɑ-CD4+T細胞MFI比值(簡稱MFI比值)。

表1 MG患者和健康對照褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達(n=15,±s)

表1 MG患者和健康對照褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達(n=15,±s)

注:MG:重癥肌無力,表2同;PBMCs:外周血單個核細胞;MFI:平均熒光強度

組別 血清褪黑素水平(pg/m L)淋巴細胞中CD4+輔助T細胞比例(%)CD4+輔助T細胞RORɑ+細胞比例(%) MFI比值 MT1相對表達 RORɑ相對表達MG組 381.2±79.34 33.66±11.72 0.68±0.45 1.11±0.18 0.35±0.16 0.57±0.23對照組 403.8±43.07 39.28±14.47 0.92±0.57 1.04±0.08 0.55±0.21 0.45±0.15 t值 0.34 0.93 1.25 0.33 2.49 1.38 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＞0.05

1.3.4 WB檢測褪黑素膜受體MT1及核受體RORɑ表達:將-80℃保存的PBMCs復蘇,用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解,取蛋白溶液,按照說明書用BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。將10μg蛋白放入電泳孔中用12%分離膠電泳。將分離蛋白轉移到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上,用兔抗人MT1抗體(1∶1000)或兔抗人RORɑ抗體(1∶1000)或鼠抗人β-actin抗體(1∶100),4℃孵育過夜。使用辣根過氧化物酶連接的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二抗(1∶3000),室溫下孵育30 min。在暗室中將WB增強化學發(fā)光劑ECLA(enhanced chemiluminescence A)和ECLB等體積混合,將PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣兩層薄膜之間,加入混合好的ECL溶液充分反應,曝光。用顯影、定影試劑進行顯影和定影。WB結果由PhotoShop整理去色,用ImageJ軟件將圖片轉化為灰度圖片,消除背景影響后設置面積、平均密度、灰度值及綜合密度為定量參數(shù),將圖片轉換成亮帶,對目的蛋白進行半定量分析:圈起每個條帶得到其綜合灰度值,計算目的蛋白與內(nèi)參(MT1/βactin,RORɑ/β-actin)綜合灰度的比值(即目的蛋白的相對表達量)。

1.3.5 相關性分析:根據(jù)定量MG評分系統(tǒng)(quantitative MG scoring system,QMGs)對患者基本嚴重程度進行評估。將MG患者血清褪黑素水平、MG患者膜受體MT1與核受體RORɑ表達與QMGs評分進行相關分析。

1.4 統(tǒng)計學處理用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析,符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差形式表示,兩均數(shù)間比較采用t檢驗;用SPSS 20.0進行相關性分析,MG患者QMGs評分與褪黑素水平以及受體表達相關性采用Spearman檢驗分析;多組均數(shù)間比較采用方差分析,兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達MG患者血清褪黑素水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,其中使用免疫抑制劑〔(387.7±76.45)pg/m L〕、未使用免疫抑制劑〔(373.7±88.02)pg/m L〕的MG患者與健康對照組〔(403.8±43.07)pg/m L〕三組間比較血清褪黑素水平差異無統(tǒng)計學意義(F=0.544,P＞0.05),三組間兩兩比較差異亦無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。流式細胞檢測結果顯示:MG患者和健康對照組淋巴細胞中CD4+輔助T細胞比例、CD4+輔助T細胞中RORɑ表達均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),患者與健康對照組MFI比值差異無統(tǒng)計學意義。WB結果顯示:MG患者PBMCs中褪黑素膜受體MT1表達明顯低于健康對照(P＜0.05),核受體RORɑ表達同健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。具體結果見表1。

2.2 相關性分析MG患者血清褪黑素水平、MG患者膜受體MT1與核受體RORɑ表達與QMGs評分均無相關性(表2)。

表2 MG患者QMGs評分與褪黑素水平及受體系統(tǒng)表達的相關性分析

3 討論

神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)是維持免疫平衡的基本網(wǎng)絡,在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。褪黑素是由松果體在夜間分泌的激素,是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中關鍵分子之一[8],對維持免疫平衡起重要作用。MG作為典型的自身免疫性疾病,有關褪黑素在MG中的作用卻鮮有研究,為進一步探討褪黑素在MG中的作用,本研究檢測了MG患者血清褪黑素水平及褪黑素受體系統(tǒng)的表達,并與疾病嚴重程度進行相關性分析。

體外研究和動物實驗發(fā)現(xiàn):T細胞與B細胞均表達褪黑素受體,褪黑素通過與其受體結合發(fā)揮抗抑郁、神經(jīng)保護、調(diào)節(jié)細胞分化等生理功能,研究人員發(fā)現(xiàn)敲除MT1受體的小鼠在強迫游泳試驗中抑郁癥發(fā)病率升高,在一些抑郁癥患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)抗MT1抗體升高,提示MT1抗體激動劑或可減輕抑郁癥患者癥狀[9];在亨廷頓小鼠模型中,褪黑素可以通過與MT1受體結合抑制線粒體性細胞凋亡通路,發(fā)揮其神經(jīng)保護功能[10];對淋巴細胞,褪黑素通過與其膜受體MT1結合抑制IL-17的產(chǎn)生[11];在SLE小鼠模型中,經(jīng)褪黑素治療的小鼠T細胞增殖能力增強,抗ss-DNA和抗組蛋白的自身Ig M抗體減少,IL-6和IL-13分泌降低,IL-2分泌增多[12],對SLE癥狀有改善作用。

本研究發(fā)現(xiàn),MG患者與健康對照相比血清褪黑素水平并無改變,為排除晝夜節(jié)律及免疫抑制劑藥物對褪黑素分泌的影響,本研究將血液標本采集時間統(tǒng)一規(guī)定在上午9:00至10:00。分別對使用和未使用免疫抑制劑的患者以及健康人血清褪黑素水平進行比較,發(fā)現(xiàn)MG患者無論是否使用免疫抑制劑,血清褪黑素水平與健康人均沒有明顯差異,且兩者間血清褪黑素水平也無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。相關性分析結果顯示,MG患者血清褪黑素水平與QMGs評分無相關性。上述結果提示MG患者褪黑素的分泌情況與其病情嚴重程度無關。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)MG患者褪黑素膜受體MT1的表達與正常對照相比顯著降低(P＜0.05),結合前述結果推測褪黑素通過膜受體MT1發(fā)揮的調(diào)節(jié)功能在MG患者中可能存在缺陷。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)MG患者與健康對照相比血清褪黑素水平并無改變,但MG者PBMCs褪黑素膜受體MT1的表達降低,提示褪黑素通過膜受體MT1發(fā)揮調(diào)節(jié)功能在MG患者中可能存在缺陷。但本研究納入病例數(shù)較少,設計可能存在一定局限性,為進一步明確褪黑素在MG中的可能作用,仍需要大樣本及有關機制研究。