徐宏炎 李夢夏 梁大業(yè) 葛雪晴 包卓華 韋敏光 劉競麗 李勁頻

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種自身抗體介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴,累及神經(jīng)-肌肉接頭的自身免疫性疾病[1]。各年齡段均可發(fā)病,可反復(fù)發(fā)作,波動進(jìn)展甚至出現(xiàn)肌無力危象而危及生命,早期診斷有利于疾病的控制。尋找眼肌型與全身型的分型標(biāo)志物有助于進(jìn)一步研究兩者間不同的發(fā)病機(jī)制。目前MG的診斷依賴于典型臨床表現(xiàn)、新斯的明試驗陽性、重復(fù)電刺激低頻遞減等,與MG相關(guān)的生物標(biāo)志物如血清乙酰膽堿受體抗體(ACh R-Ab)、抗骨骼肌抗體等尚不能對進(jìn)行分型診斷及預(yù)后判斷[2]。因此尋找靈敏度及特異度更高的分型診斷標(biāo)志物具有重要臨床意義。

microRNA(miRNA)是一種內(nèi)生的,長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA,可通過靶向結(jié)合信使RNA(m RNA)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)水平。研究表明,miRNA的表達(dá)異常與腫瘤、炎性反應(yīng)及自身免疫性疾病(如MG)相關(guān)[3-5],并可作為疾病的生物標(biāo)志物[6-10],但miRNA具有易降解的特點,降低了其作為生物標(biāo)志物的能力。外泌體作為細(xì)胞分泌的泡狀小體,內(nèi)含多種蛋白、脂質(zhì)、核酸分子,能保護(hù)RNA免受核酸酶的降解,是血漿miRNA富集體;外泌體源性miRNA能反映來源細(xì)胞的功能、狀態(tài),可預(yù)測疾病的演變和治療反應(yīng),具有作為生物標(biāo)志物的潛力[11-12]。本研究通過深度測序及qRT-PCR技術(shù)檢測MG患者血漿外泌體源性miRNA的表達(dá)差異,并評估其作為生物標(biāo)志物的可能性。

1 對象和方法

1.1 對象納入2017年3月至2018年7月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的MG患者44例,其中眼肌型18例,全身型26例。MG診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)表現(xiàn)為骨骼肌無力,伴有典型的活動后癥狀加重、休息后減輕或晨輕暮重現(xiàn)象,且肌疲勞試驗陽性。(2)新斯的明試驗陽性。(3)肌電圖檢查呈現(xiàn)低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激波幅遞減和(或)單纖維肌電圖顫抖(Jitter)增寬。(4)血清AChR-Ab升高。具備上述診斷標(biāo)準(zhǔn)中的(1),同時至少具備(2)～(4)中的一項,即診斷為MG。排除標(biāo)準(zhǔn):排除妊娠期女性,以及合并心、肺、肝、腎功能衰竭者。另選擇同期性別、年齡相匹配的健康體檢者44名作為對照組。本研究經(jīng)作者醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過,入組者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:收集入組對象性別、年齡情況,并記錄 MG患者病程、合并其他免疫性疾病(甲狀腺功能亢進(jìn)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征)、抗ACh R-Ab、胸腺病理檢查以及治療等情況。根據(jù)美國MG協(xié)會提出的定量重癥肌無力評分(QMGS)進(jìn)行病情嚴(yán)重程度評價。

1.2.2 主要試劑與設(shè)備:包括外泌體試劑盒exo RNeasy Serum/Plasma Midi Kit(德國Qiagen公司)、H7650透射電鏡(日本日立公司)、納米粒徑分析儀(ZETASIZER Nano series-Nano-ZS,英國Malvern公司)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司)、exoRN-easy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒(德國 Qiagen 公司)、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒 (日本Ta KaRa公司)、Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀(美國 Applied Biosystems公司)、CD63-Antibody及CD81-Antibody(美國BD公司)、PCR引物(日本TaKaRa公司)、熒光定量PCR試劑盒(日本Ta KaRa公司)。

1.2.3 血漿采集:用含EDTA抗凝管采集全血5 m L,4℃靜置2 h,以3300g離心15 min,取上清,分裝至微型離心管并保存至-80℃冰箱備用。

1.2.4 外泌體的鑒定:取700μL血漿,按外泌體試劑盒exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit說明書提取外泌體,并進(jìn)行外泌體鑒定。(1)外泌體鑒定:將外泌體懸浮于無酶水中,滴于200目銅網(wǎng),靜置1 min,干燥后用1%(質(zhì)量濃度)磷鎢酸染色20 s,樣本干燥后在透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)。(2)粒徑檢測:使用納米粒徑分析儀對樣本粒徑進(jìn)行檢測(由廣州銳博公司檢測)。(3)表面標(biāo)志物檢測:采用流式細(xì)胞儀對樣本表面特異性標(biāo)志蛋白CD63和CD81進(jìn)行檢測(由廣州銳博公司檢測)。

1.2.5 提取外泌體小RNA進(jìn)行深度測序:隨機(jī)選擇眼肌型、全身型MG患者各4例以及對照組2名血漿樣本送銳博生物有限公司(中國,廣州)進(jìn)行檢測。取長度為18～30核苷酸的小RNA構(gòu)建文庫,基于Illumina HiSeq 2500平臺對上述文庫進(jìn)行深度測序,采用Edge R軟件分析比較兩組間的miRNA表達(dá)差異。

1.2.6 提取RNA進(jìn)行實時熒光定量PCR:采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒提取MG患者及正常對照者血漿外泌體源性RNA,使用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用熒光定量PCR試劑盒及Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀,使用U6作為內(nèi)參進(jìn)行PCR檢測。使用ABI 7500 Software V2.3計算其CT值,通過2-ΔΔCt公式計算MG患者與正常組miRNA相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗,符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩均數(shù)間比較采用t檢驗,多組均數(shù)間比較采用方差分析;非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表述,兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗,多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗,兩兩比較采用Nemenyi法檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗,當(dāng)n＜40或T＜1時采用四表格確切概率法;MG患者外泌體源性miRNA表達(dá)與MG病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析;繪制ROC曲線評估m(xù)iRNA對MG的診斷價值。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較44例MG患者中6例患者合并其他免疫性疾病,各組間性別、年齡、AChRAb、胸腺瘤、合并疾病、藥物治療及病程比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(均P＞0.05)。具體結(jié)果見表1。

2.2 外泌體鑒定透射電鏡下觀察外泌體直徑約為100 nm(圖1),粒徑檢測顯示其平均粒徑41.8 nm,其中20～200 nm者占81.6%,粒徑分布系數(shù)為0.475。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD63陽性率85.7%,CD81陽性率60.0%(圖2)。上述結(jié)果表明所提取外泌體符合正常特征。

圖1 電鏡下觀察外泌體形態(tài)特征(箭頭所示)

2.3 血漿外泌體源性miRNA相對表達(dá)量深度測序結(jié)果示,與對照組比較,MG患者血漿中存在68個miRNA異常表達(dá)(以差異倍數(shù)＞1.5,P＜0.05為界限),其中43個miRNA下調(diào),25個miRNA上調(diào)(表2)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,眼肌型 MG、全身型 MG、對照組血漿外泌體源性miR-1224-5p表達(dá)水平中位數(shù)(四分位數(shù)間距)分別為6.41(3.61)、14.18(13.49)、2.74(2.91),各組間其相對表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=46.325,P=0.000),兩兩比較顯示,眼肌型組其水平較對照組升高(Z=-21.578,P=0.008),全身型組較眼肌型組升高(Z=-21.098,P=0.021)。結(jié)果見圖3。

表1 各組臨床資料比較

圖2 流式細(xì)胞儀檢測外泌體表面特異性標(biāo)志CD63和CD81表達(dá)水平

表2 血漿外泌體源性miRNA深度測序結(jié)果

2.4 外泌體源性miRNA表達(dá)與MG病情嚴(yán)重程度相關(guān)性MG患者血漿外泌體源性miR-1224-5p相對表達(dá)量與QMGS呈正相關(guān)(r=0.428,P=0.004)。結(jié)果見圖4。

圖3 各組血漿外泌體miR-1224-5p相對表達(dá)水平比較

圖4 MG患者血漿外泌體miR-1224-5p相對表達(dá)量與病情嚴(yán)重程度相關(guān)分析

2.5 血漿外泌體源性miRNA相對表達(dá)量與AChR-Ab的關(guān)系共33例MG患者檢測血漿ACh R-Ab,其中ACh R-Ab陽性22例,陰性11例(表1)。AChR-Ab陽性組和陰性組miR-1224-5p相對表達(dá)水平中位數(shù)(四分位數(shù)間距)分別為33.18(28.11)、44.83(39.67),兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.191,P=0.849)。

2.6 血漿外泌體源性miR-1224-5p在MG中的診斷價值ROC曲線分析結(jié)果顯示,與健康對照組相比,眼肌型和全身型MG組其ROC曲線下面積分別為0.793(P＜0.01)、0.932(P＜0.01);與眼肌型MG相比,全身型MG組其ROC曲線下面積為0.806(P=0.001)(圖5)。

3 討論

MG按病變累及部位可分為眼肌型與全身型,兩者在發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、治療策略及預(yù)后方面均存在差異[13-14]。眼肌型多為晚發(fā)型,男性多見,胸腺多正?；蛭s,部分患者病情加重可進(jìn)展為全身型;全身型多為早發(fā)型,女性多見,常有胸腺增生或合并胸腺瘤[15]。尋找與MG相關(guān),尤其是能對分型進(jìn)行診斷的生物標(biāo)志物有利于探討MG發(fā)病機(jī)制,有利于MG的診斷、確定藥物靶向以及精準(zhǔn)治療。ACh R-Ab是研究較為深入的MG致病性抗體,眼肌型MG患者其陽性率約50%,全身型約80%[16],但其并非MG的特異性抗體,在急性脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎[17]、Lambert-Eaton綜合征[18]、肌萎縮側(cè)索硬化[19]等其他免疫性疾病及健康人群中亦可發(fā)現(xiàn)ACh R-Ab[20]。越來越多研究結(jié)果顯示,除AChR-Ab外,諸如連接素抗體(anti-Titin antibody,Titin-Ab)、Ryanodine受體抗體(Ryanodine receptor antibody,Ry R-Ab)、肌肉特異性酪氨酸激酶抗體(muscle specific tyrosine kinase antibody,MuSK-Ab)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4抗體(LPP4-Ab)等相關(guān)抗體均可能與MG發(fā)病相關(guān)。如有研究發(fā)現(xiàn)Titin-Ab及Ry R-Ab與MG病情嚴(yán)重程度相關(guān)[21-22],但與治療反應(yīng)及MG分型關(guān)系的報道較少;MuSK-Ab、LRP4-Ab在 MG患者中陽性率較低,分別為4.2%和1%～5%[23],且其特異性不高,尚可見于其他免疫性疾病[24]。因此,目前尚缺乏用于MG診斷的可靠生物標(biāo)志物。高通量測序技術(shù)及針對外泌體小RNA功能研究的發(fā)展為尋找新型生物標(biāo)志物提供了前提條件。

圖5 血漿外泌體源性miR-1224-5p診斷MG的ROC曲線分析結(jié)果

本研究通過對MG患者血漿外泌體源性RNA深度測序發(fā)現(xiàn),與健康人相比,miR-1224-5p在MG患者中表達(dá)明顯上調(diào),通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站miR3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和生物通路數(shù)據(jù)網(wǎng)站KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/)分析發(fā)現(xiàn),其靶基因富集于多個與免疫反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的通路[25-26],如hsa04660_T_cell_receptor_signaling_pathway,hsa04068_Fox O_signaling_pathway,hsa04010_MAPK_signaling_pathway[27]。有研究表明其在結(jié)腸癌、肺癌中異常表達(dá),且與臨床治療和預(yù)后相關(guān)[28-30],有研究還發(fā)現(xiàn)了其靶基因包含MG相關(guān)的風(fēng)險基因[27],提示其與腫瘤及免疫性疾病相關(guān)。本研究進(jìn)一步行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),miR-1224-5p在眼肌型及全身型MG患者中的表達(dá)均較正常對照組升高,且全身型患者其表達(dá)較眼肌型高,相關(guān)性分析顯示其表達(dá)與MG病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),提示其表達(dá)水平與MG的發(fā)生可能存在一定相關(guān)性。MG的臨床特征與胸腺病理及AChR-Ab密切相關(guān)[13,16]。本研究并未發(fā)現(xiàn)胸腺增生組和胸腺瘤組、ACh R-Ab陽性組和陰性組之間血漿外泌體源性miR-1224-5p表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異,提示miR-1224-5p的表達(dá)與胸腺病理分類及AChR-Ab可能無明顯相關(guān)性。ROC曲線分析顯示,與健康對照組比較,血漿外泌體源性miR-1224-5p診斷眼肌型和全身型MG患者的ROC曲線下面積分別為0.793和0.932;與眼肌型比較,其在診斷全身型MG組的ROC曲線下面積為0.806,提示血漿外泌體源性miR-1224-5p可能成為MG診斷及分型的生物標(biāo)志物。

綜上所述,本文研究結(jié)果顯示血漿外泌體源性miR-1224-5p有可能成為MG分型診斷的生物標(biāo)志物。但本研究存在如下不足:首先納入樣本量較小,尚缺乏代表性;其次,僅在qRT-PCR水平檢測血漿外泌體源性miR-1224-5p的表達(dá),有必要結(jié)合其靶基因表達(dá)水平進(jìn)行功能研究;第三,目前僅檢測miRNA-1224-5p在MG與健康人之間的表達(dá)差異,為驗證其特異性,需要進(jìn)一步收集其他神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病作為對照組進(jìn)行研究。因此,有關(guān)血漿外泌體源性miR-1224-5p在MG致病機(jī)制、診斷分型中的確切作用尚需進(jìn)一步研究。