何愛(ài)娟 張?zhí)煊?/p>

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼耳鼻整形外科 上海 200031)

軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程最成熟的種子細(xì)胞[1-2]，但來(lái)源不足、供區(qū)軟骨缺損、去分化[3-5]等問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用范圍。與軟骨細(xì)胞不同的是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有來(lái)源豐富、可大量擴(kuò)增、成軟骨能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[6-8]，因此是軟骨組織工程的理想種子細(xì)胞。

前期研究已證實(shí)：在關(guān)節(jié)微環(huán)境中，應(yīng)用自體BMSCs復(fù)合聚羥基乙酸/聚乳酸(polyglycolic acid/polylactic acid，PGA/PLA)可成功修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨與骨復(fù)合缺損[8-9]；而在皮下微環(huán)境中，BMSCs極易發(fā)生血管化、骨化[10-11]，難以獲得理想的軟骨再生效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)充分的體外軟骨定向誘導(dǎo)可以有效解決這一問(wèn)題。由此可見(jiàn)，體外軟骨構(gòu)建對(duì)BMSCs的軟骨再生穩(wěn)定性十分重要(皮下環(huán)境)。然而，BMSCs體外構(gòu)建的軟骨組織在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生化組成上能否達(dá)到軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建軟骨水平？其與軟骨細(xì)胞的體外軟骨形成規(guī)律是否有差異？這些與臨床轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的問(wèn)題目前尚未明確。而闡明這些對(duì)BMSCs的臨床應(yīng)用十分重要，因?yàn)槊鞔_軟骨形成規(guī)律是把握體外誘導(dǎo)時(shí)間及體內(nèi)回植時(shí)機(jī)的關(guān)鍵；明確軟骨形成質(zhì)量是決定BMSCs能否應(yīng)用于臨床的前提。

為了闡明上述問(wèn)題，本研究分別將豬的BMSCs及軟骨細(xì)胞復(fù)合PGA/PLA支架后進(jìn)行體外軟骨構(gòu)建，前者為實(shí)驗(yàn)組，后者為對(duì)照組。體外構(gòu)建2、4及8周后，取材檢測(cè)各組的大體、組織學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞外基質(zhì)含量，評(píng)估各組的軟骨形成規(guī)律和形成質(zhì)量，明確BMSCs與軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建軟骨的異同，為BMSCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)液、低糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰酶、三抗(Hyclone公司，美國(guó))、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白、L-谷氨酰胺、維生素C、番紅O染料(Sigma公司，美國(guó))、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸(insulin-transferrin-sodium,ITS；R&D公司，美國(guó))、聚羥基乙酸(project of global access,PGA；國(guó)睿生命科技有限公司，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5月齡巴馬香豬3只，體重20 kg，雌雄不限(上海甲干生物科技有限公司)。

1.2.2 豬BMSCs的分離培養(yǎng) 每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抽取10 mL骨髓，參照全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行BMSCs的分離培養(yǎng)[12]。以含10%FBS、10 ng/mL b-FGF的DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，5 d后首次換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)近70%～80%匯合時(shí)按1×104個(gè)/ cm2傳代培養(yǎng)，收集第2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 無(wú)菌獲取相同個(gè)體豬的部分耳郭軟骨，隨后按照前期建立的軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)方法[13]，分離獲取軟骨細(xì)胞，以含10%FBS、10 ng/mL b-FGF的DMEM高糖培養(yǎng)液(普通培養(yǎng)液)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)近80%～90%匯合時(shí)可行傳代培養(yǎng)，收集第2代細(xì)胞備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

1.2.4 PGA/PLA支架材料制備 無(wú)紡的15 mg PGA均勻放入直徑10 mm的模具中壓制成圓柱狀，加入0.5%PLA定型，制備成直徑10 mm、厚度1.5 mm的圓柱體支架材料[13]，滅菌后備接種細(xì)胞用(圖1A)。

1.2.5 細(xì)胞接種及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 細(xì)胞體外擴(kuò)增到第2代時(shí)，用倒置相差顯微鏡下觀察其細(xì)胞狀態(tài)，初步評(píng)估細(xì)胞功能。隨后分別收集第2代BMSCs及軟骨細(xì)胞，以普通培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸成100×106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，將后者接種于PGA/PLA支架材料上(圖1B)，孵育4 h后，以成軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)(含0.3 g/LL-谷氨酰胺、0.05 g/L抗壞血酸、3.7 g/L碳酸氫鈉、10萬(wàn)U/L青霉素鉀、0.1 g/L硫酸鏈霉素、10 ng/mL TGF-β1、100 ng/mL IGF-I、1%ITS、40 ng/mL地塞米松的高糖DMEM培養(yǎng)液)。軟骨細(xì)胞-PGA/PLA組為對(duì)照組，BMSCs/PGA組為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均經(jīng)體外培養(yǎng)2、4、8周后取樣行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞在材料上的基質(zhì)分泌情況檢測(cè) 細(xì)胞材料復(fù)合物體外培養(yǎng)2、4周時(shí)，每組各取3個(gè)樣本于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞在材料上的黏附及基質(zhì)分泌情況。

1.2.7 構(gòu)建軟骨的大體觀察、組織學(xué)檢測(cè) 細(xì)胞材料復(fù)合物體外培養(yǎng)4、8周時(shí)，每組各取3個(gè)樣本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)檢測(cè)。蘇木素-伊紅染色觀察組織細(xì)胞形態(tài)；番紅O染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)中GAG的合成和分泌情況；Ⅱ型膠原免疫組化觀察細(xì)胞Ⅱ膠原蛋白的合成和分泌情況，具體實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)前期建立的檢測(cè)體系[14-15]。

1.2.8 構(gòu)建軟骨的定量檢測(cè) 細(xì)胞材料復(fù)合物體外培養(yǎng)4、8周時(shí)，每組各取5個(gè)樣本進(jìn)行濕重、GAG、Ⅱ型膠原等定量測(cè)定。阿利辛蘭法測(cè)定樣本的GAG含量；ELISA法測(cè)定樣本的Ⅱ型膠原含量，具體實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)前期建立的檢測(cè)體系[14-15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5軟件分析數(shù)據(jù)。行t檢驗(yàn)分析定量數(shù)據(jù)的組間差異，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及功能 細(xì)胞形態(tài)是細(xì)胞功能的重要體現(xiàn)。從圖1C、D上可見(jiàn)，擴(kuò)增到第2代的軟骨細(xì)胞呈多角形或長(zhǎng)梭形，未見(jiàn)明顯老化現(xiàn)象，間接說(shuō)明其細(xì)胞功能保持尚可；而擴(kuò)增到第2代的BMSCs則以多角形細(xì)胞為主，細(xì)胞有較多角狀突起，增殖也較快，說(shuō)明細(xì)胞活性好。

圖1. 細(xì)胞及支架材料 A.擴(kuò)增到第2代的BMSCs；B.同一個(gè)體的耳軟骨細(xì)胞(第2代細(xì)胞)；C.PGA/PLA支架材料；D.細(xì)胞/材料復(fù)合物

2.2 細(xì)胞在直接材料上的基質(zhì)分泌情況 體外培養(yǎng)2周時(shí)，BMSCs在支架材料上的基質(zhì)分泌厚度顯著低于軟骨細(xì)胞組，但誘導(dǎo)到4周時(shí)，BMSCs的基質(zhì)厚度及材料的基質(zhì)包裹情況與軟骨細(xì)胞組十分接近(圖2)。這些結(jié)果說(shuō)明，BMSCs在體外成軟骨誘導(dǎo)的早期，基質(zhì)分泌能力明顯低于軟骨細(xì)胞，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，基質(zhì)分泌能力明顯提高，4周時(shí)BMSCs的基質(zhì)分泌能力基本能達(dá)到軟骨細(xì)胞水平。

圖2. 細(xì)胞在PGA/PLA支架材料上的基質(zhì)分泌情況 體外構(gòu)建2周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞外基質(zhì)厚度及其包裹材料程度低于對(duì)照組；4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞外基質(zhì)厚度及其包裹材料程度與對(duì)照組未見(jiàn)明顯差異

2.3 體外軟骨形成大體觀及濕重檢測(cè) 體外軟骨構(gòu)建4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均形成了瓷白色的軟骨樣組織，但大體觀上可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組的厚度及致密程度較對(duì)照組低(圖3)，濕重檢測(cè)進(jìn)一步說(shuō)明了這一點(diǎn)(圖4A)，誘導(dǎo)到8周時(shí)，2組均形成了表面光滑、瓷白色的軟骨樣組織(圖3)，且濕重已無(wú)明顯差別(圖4A)。這些結(jié)果說(shuō)明隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，BMSCs的軟骨形成逐漸趨于成熟。

圖3. 體外軟骨形成大體觀 體外構(gòu)建4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均形成了瓷白色的軟骨樣組織，外觀上看，前者的厚實(shí)度略低于后者；體外8周時(shí)，兩者均形成了厚實(shí)、均質(zhì)的軟骨樣組織，二者在大體觀上未見(jiàn)明顯差異

圖4. 體外軟骨形成的相關(guān)定量檢測(cè) 體外4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組的濕重、GAG及Ⅱ膠原含量均低于對(duì)照組；而體外培養(yǎng)到8周時(shí)，BMSCs體外構(gòu)建的軟骨濕重、GAG及Ⅱ膠原含量基本上達(dá)到了軟骨細(xì)胞組的水平。有相同字母的柱狀圖表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無(wú)相同字母的表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.4 體外軟骨形成組織學(xué)及定量檢測(cè) 誘導(dǎo)4周后，2組蘇木素-伊紅染色均觀察到明顯的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，陷窩周圍均有藍(lán)染的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，番紅O染色及Ⅱ型膠原染色均呈陽(yáng)性。但實(shí)驗(yàn)組的軟骨陷窩數(shù)量較軟骨組少，細(xì)胞外基質(zhì)的藍(lán)染程度、番紅O和Ⅱ膠原的著色程度也明顯淺于對(duì)照組(圖5)。這些結(jié)果說(shuō)明體外誘導(dǎo)4周后，BMSCs已初步形成軟骨樣組織，但其成熟度明顯低于對(duì)照組。誘導(dǎo)8周，實(shí)驗(yàn)組的軟骨陷窩數(shù)量明顯增多，陷窩周圍基質(zhì)的藍(lán)染程度、番紅O和Ⅱ型膠原的著色程度均較4周時(shí)加深，且與對(duì)照組未觀察到明顯差異(圖5)。Ⅱ型膠原及GAG定量檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了組織學(xué)的檢測(cè)結(jié)果(圖4B、C)。所有這些結(jié)果說(shuō)明，體外軟骨定向誘導(dǎo)8周后BMSCs基本上形成了成熟的軟骨組織，同時(shí)也說(shuō)明通過(guò)延長(zhǎng)體外誘導(dǎo)時(shí)間可顯著縮小BMSCs構(gòu)建軟骨與軟骨細(xì)胞構(gòu)建軟骨在組織結(jié)構(gòu)及生化組成上的差異。

圖5. 體外軟骨形成的相關(guān)組織學(xué)檢測(cè) 體外4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有軟骨陷窩形成，番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色均呈陽(yáng)性，但實(shí)驗(yàn)組的陷窩數(shù)量較軟骨組少，細(xì)胞外基質(zhì)的藍(lán)染程度、番紅O和Ⅱ型膠原的著色程度也淺于對(duì)照組。誘導(dǎo)8周后，實(shí)驗(yàn)組的軟骨陷窩數(shù)量及陷窩周圍基質(zhì)的藍(lán)染程度、番紅O和Ⅱ型膠原的著色程度明顯增高，且與對(duì)照組十分接近

3 討論

BMSCs是軟骨組織工程最有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一[6, 8]。盡管基于BMSCs的軟骨組織工程修復(fù)技術(shù)已在動(dòng)物體內(nèi)取得較大成功[8-9]，但其臨床轉(zhuǎn)化尚未獲得重要突破[16]。主要原因在于與臨床轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的一些問(wèn)題尚未明確。如：BMSCs的體外軟骨形成規(guī)律如何？其軟骨形成規(guī)律與目前最成熟穩(wěn)定的軟骨再生模式——軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建軟骨是否有差異？如果存在差異，那么這些差異能否通過(guò)延長(zhǎng)體外誘導(dǎo)時(shí)間、優(yōu)化誘導(dǎo)條件等縮??？BMSCs體外構(gòu)建的軟骨最終能否達(dá)到軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建軟骨的水平？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BMSCs體外構(gòu)建軟骨在4周時(shí)軟骨初步形成，8周時(shí)軟骨基本成熟；BMSCs的體外三維軟骨形成規(guī)律與軟骨細(xì)胞的軟骨形成確實(shí)存在差異，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異逐漸減少直至消失。

然而是什么原因?qū)е律鲜霾町悘挠械綗o(wú)的變化過(guò)程？本研究結(jié)果表明，在軟骨形成早期即體外軟骨定向誘導(dǎo)2周左右時(shí)，倒置顯微鏡下觀察到軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌較BMSCs的基質(zhì)分泌明顯旺盛，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，基質(zhì)分泌差異逐漸減小。誘導(dǎo)滿4周后二者的基質(zhì)分泌在倒置顯微鏡下已無(wú)明顯差別。雖然鏡下基質(zhì)分泌情況差異不明顯，但組織學(xué)上仍可觀察到BMSCs組形成的軟骨陷窩數(shù)量明顯少于軟骨細(xì)胞組；軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)GAG和Ⅱ型膠原的定性、定量檢測(cè)更是提示了BMSC組的細(xì)胞外基質(zhì)含量明顯低于軟骨細(xì)胞組。這說(shuō)明在誘導(dǎo)早期，BMSCs構(gòu)建的軟骨成熟度顯著低于軟骨細(xì)胞組。這種差異可能是由于誘導(dǎo)早期BMSCs尚未轉(zhuǎn)化成為軟骨樣細(xì)胞，因此細(xì)胞外基質(zhì)的分泌能力仍較低；而軟骨細(xì)胞是成熟的終末分化細(xì)胞，無(wú)需經(jīng)誘導(dǎo)分化就具有分泌軟骨特異蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白的能力。誘導(dǎo)到8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均形成了瓷白色的軟骨樣組織，組織學(xué)、免疫組織化學(xué)及特異性細(xì)胞外基質(zhì)的定量測(cè)定結(jié)果顯示，此2種細(xì)胞所構(gòu)建的組織工程軟骨在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生化組成上已無(wú)明顯差別。這可能是由于這時(shí)候的BMSCs已經(jīng)完全轉(zhuǎn)化成為較為成熟的軟骨樣細(xì)胞，可大量分泌軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)，從而使二者的差異顯著縮小，甚至消失。

盡管在誘導(dǎo)早期，BMSCs的軟骨形成較軟骨細(xì)胞慢，但通過(guò)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間二者的差異顯著縮小，誘導(dǎo)超過(guò)8周時(shí)，BMSCs構(gòu)建的軟骨與軟骨細(xì)胞構(gòu)建的軟骨并無(wú)顯著差異。這些結(jié)果為BMSC的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了有利的理論依據(jù)。此外，課題組前期研究表明：應(yīng)用未經(jīng)體外軟骨定向誘導(dǎo)的BMSC-PGA/PLA復(fù)合物雖可實(shí)現(xiàn)大動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)，但其成功率低[16]。Angele等[17]將未經(jīng)體外成軟骨誘導(dǎo)的兔BMSCs與人工材料復(fù)合后植入裸鼠的皮下和背部肌肉內(nèi)，3周后植入物出現(xiàn)了骨樣組織形成(軟骨再生失敗)。這些結(jié)果說(shuō)明，對(duì)BMSCs而言，單純依靠體內(nèi)微環(huán)境構(gòu)建軟骨的結(jié)果極不穩(wěn)定。而課題組另一研究表明，將BMSCs復(fù)合支架材料體外成軟骨誘導(dǎo)8～12周后再植入裸鼠皮下，則可獲得穩(wěn)定的軟骨再生效果[10]。這些結(jié)果提示，要應(yīng)用BMSCs修復(fù)整形外科中常見(jiàn)的軟骨缺損，進(jìn)行充分的體外軟骨定向誘導(dǎo)和構(gòu)建十分重要而且必要。

總之，本研究證明BMSCs體外構(gòu)建軟骨隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸趨于成熟，其體外構(gòu)建軟骨在組織結(jié)構(gòu)和生化組成上能達(dá)到軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建軟骨的水平。這為BMSC的臨床應(yīng)用提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但關(guān)于BMSC體外構(gòu)建組織工程軟骨的體內(nèi)長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸、體內(nèi)應(yīng)用穩(wěn)定性等相關(guān)問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。