李海英，周斌，吳建波，邢沖云

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.中心實驗室；2.血液內(nèi)科）

AML1-ETO易位是急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）中最常見的染色體異常之一。由此產(chǎn)生的AML1-ETO融合蛋白由野生型AML1蛋白的NH2末端部分和幾乎整個ETO蛋白質(zhì)序列組成，AML1-ETO通過抑制正常的AML1功能在白血病轉(zhuǎn)化中發(fā)揮起始和關(guān)鍵性作用[1]。AML1-ETO與其他基因突變?nèi)鏑EBPA[2]、c-kit[3]或RTK[4]協(xié)同迅速誘導(dǎo)白血病的發(fā)生。

和厚樸酚（Honokiol，HNK）是一種從植物厚樸的莖和皮中分離得到的天然酚類化合物[5]，能通過靶向多種信號傳導(dǎo)分子包括Wnt1-β-catenin[6]、JAK2/STAT3[7-8]和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）[9]，發(fā)揮抗腫瘤和抗血管生成活性。我們已經(jīng)報道過HNK對AML有治療作用[10]，并在前期實驗中發(fā)現(xiàn)HNK能引起AML1-ETO蛋白的降解。本實驗旨在研究HNK降解AML1-ETO蛋白的可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人AML1-ETO+白血病細胞株Kasumi-1 購自ATCC，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。分別將10、20、40 μmol/L HNK加入細胞上清液中，待24 h和48 h后提取mRNA和蛋白。10 μg/mL放線菌酮（美國Sigma公司）分別加入含或不含40 μmol/L HNK的Kasumi-1細胞中，于0、4、8、12、16、24 h提取蛋白進行檢測。

1.2 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達 相關(guān)抗體包括AML1（美國CST公司）、ETO（美國Santa Cruz Bio-technology公司）、UbcH8（美國Abcam公司）、β-actin（德國Merck Millipore公司）。按標準流程操作，在Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上拍照，使用Quantity One分析軟件分析灰度值。

1.3 mRNA的提取和實時定量PCR（qRT-PCR） TRIzol 法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）合成cDNA，用AML1-ETO和UbcH8上下游引物PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，SYBR Green熒光染料法相對定量，使用ABI7500熒光定量PCR儀檢測。引物由上海生工合成，序列見表1。

1.4 基因芯片分析 從40 μmol/L HNK處理24 h的Kasumi-1細胞中提取總RNA，通過Super Script II 反轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrogen公司）將總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA并擴增，將cDNA雜交到人基因芯片3’IVT表達試劑盒（美國Affymetrix公司）上。使用PartekGS6.5 軟件包（美國Affymetrix公司）進行分位數(shù)標準化和隨后的數(shù)據(jù)處理。由陣列表示的所有基因在特定產(chǎn)物的熔解曲線上顯示單峰。使用由制造商提供的基于Excel的PCR陣列數(shù)據(jù)分析軟件來分析基因表達。基因科技（上海）股份有限公司完成了基因芯片分析。

表1 引物序列

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建 為了產(chǎn)生UbcH8（UBE2L6；NM_ 004223）過表達質(zhì)粒，通過PCR擴增人UbcH8編碼序列，然后將其克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-puro（美國Clontech公司）中。設(shè)計針對UbcH8的基因特異性短發(fā)夾RNA（shRNA），并將其克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN-RetroQ（美國Clontech公司）中。所有質(zhì)粒構(gòu)建的引物序列如表1所示。

1.6 包裝反轉(zhuǎn)錄病毒和細胞轉(zhuǎn)染 將HEK-293T細胞（4×106）鋪在10 cm培養(yǎng)皿中。24 h后，用包裝質(zhì)粒Gap-pol和VSV-G載體將MSCV-puro-UbcH8、MSCV-puro-AML1-ETO、pSIREN-UbcH8或陰性對照載體共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后從上清液中收集病毒，并進一步通過0.45 μmol/L濾器（德國Merck公司）過濾。將白血病細胞（2×105/mL）懸浮于含有8 μg/mL polybrene（美國Sigma公司）的病毒上清液中并以2 000 r/min離心2 h。嘌呤霉素 2 μg/mL（美國MCE公司）加入到上清液中1周以選擇陽性克隆。

1.7 t（8；21）白血病小鼠模型 從上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司購買雄性無胸腺裸鼠和C57BL/6小鼠（4周齡），動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，并將其放置在墊料籠中，12 h光暗循環(huán)，可用的食物和水。對于裸鼠的異種移植模型，將1×107個Kasumi-1細胞與高濃度的Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）1:1比例混合，皮下注射到每只裸鼠的右側(cè)。2周后，將小鼠隨機分為2組。1組小鼠（n=5）每周3次腹膜內(nèi)注射溶于20%脂肪乳劑的HNK（3 mg/d）；另1組小鼠（n=5）接受等體積的脂肪乳劑，并作為對照組。當(dāng)腫瘤細胞接種6周后，處死小鼠，實驗終止，收集每只小鼠的腫瘤組織。記錄腫瘤體積。使用等式V（inmm3）=A×B2/2來測量腫瘤體積，其中A是最大直徑，B是垂直直徑。所有組的腫瘤組織迅速在液氮中冷凍備用。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件。計量資料兩兩比較用獨立樣本t檢驗，多組比較用單因素方差分析，不同時間2組間比較用重復(fù)測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNK誘導(dǎo)AML1-ETO蛋白的降解 將攜帶內(nèi)源性AML1-ETO的Kasumi-1細胞分別用10、20和40 μmol/L HNK處理不同的時間，Western blot檢測結(jié)果表明，HNK能減少Kasumi-1細胞中的AML1-ETO融合蛋白，并且具有濃度和時間依賴性（見圖1A-C）；然而，HNK并沒有改變Kasumi-1細胞中的AML1-ETO mRNA表達水平（見圖1D）。將Kasumi-1細胞用含有或不含HNK的蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮處理不同時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNK處理的Kasumi-1細胞中AML1-ETO蛋白的半衰期明顯短于未處理的細胞（見圖1E），表明HNK處理后AML1-ETO蛋白的穩(wěn)定性變低。

圖1 HNK誘導(dǎo)的AML1-ETO降解

2.2 通過基因芯片分析尋找目標基因 使用基因芯片分析來比較HNK處理前后的Kasumi-1細胞中mRNA表達，結(jié)果表明，HNK增加了1 168個不同的基因（＞2倍）和降低了212個不同的基因（＜2倍）（見圖2A-B），其中UbcH8（一種E2結(jié)合酶[11]）表達提高了約4倍（見圖2C）。

2.3 UbcH8在HNK誘導(dǎo)的AML1-ETO蛋白降解中的作用 將Kasumi-1細胞用40 μmol/L HNK處理24 h和48 h，HNK顯著增加Kasumi-1細胞中UbcH8的mRNA和蛋白表達（P＜0.05），見圖3A-B。用反轉(zhuǎn)錄病毒MSCV-UbcH8轉(zhuǎn)染Kasumi-1細胞，使Kasumi-1細胞中的UbcH8過表達，實驗結(jié)果顯示，UbcH8的過度表達有效地誘導(dǎo)了AML1-ETO的降解（見圖3C）。UbcH8被特定的shRNA敲除后，在Kasumi-1細胞中，2個獨立的shRNA有效地降低了UbcH8蛋白的表達（見圖3D）。此外，穩(wěn)定敲除UbcH8的Kasumi-1細胞用HNK處理，結(jié)果表明，敲除UbcH8后HNK對AML1-ETO蛋白的降解被阻斷（見圖3E）。

2.4 HNK在Kasumi-1異種移植小鼠模型中的作用 HNK處理的小鼠中的腫瘤體積顯著小于對照小鼠中的腫瘤，見圖4A。與對照小鼠相比，HNK處理后小鼠的腫瘤生長速度顯著降低，見圖4B。與對照小鼠相比，用HNK處理過的小鼠獲得的腫瘤中AML1-ETO的蛋白質(zhì)水平顯著降低，UbcH8表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4C。

圖2 基因芯片分析結(jié)果

3 討論

t（8；21）易位產(chǎn)生AML1-ETO蛋白，它能抑制普通AML1蛋白的功能，導(dǎo)致造血細胞生物學(xué)特性改變，從而在白血病的轉(zhuǎn)化過程中起到關(guān)鍵作用[12-14]。 轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，單獨AML1-ETO基因表達并不能誘發(fā)白血病，AML1-ETO聯(lián)合其他致癌基因如WT1（Wilm’s tumor-1）、KRAS等快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠白血病[15-16]。進一步研究發(fā)現(xiàn)AML1-ETO聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）增強白血病細胞增殖，促進小鼠白血病發(fā)生發(fā)展[17]。這些研究結(jié)果提示：t（8；21）易位陽性的M2型AML的發(fā)生是在AML1-ETO融合蛋白的基礎(chǔ)上需要聯(lián)合其他遺傳學(xué)改變，也就是所謂的“二次打擊”，共同作用，最終引發(fā)白血病。

HNK是從植物厚樸的干皮、根及樹葉中提取的中藥單體，最近研究結(jié)果顯示HNK對乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌、口腔鱗癌等有很好的療效[18-22]。我們已經(jīng)報道過HNK可以誘導(dǎo)AML細胞周期停滯和凋亡，但對正常的造血干細胞沒有影響[10]。我們又在前期實驗中發(fā)現(xiàn)HNK能夠降解白血病細胞中的AML1-ETO蛋白，因此我們進一步研究了HNK降解AML1-ETO蛋白的可能機制。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，HNK對AML1-ETO的降解具有時間和濃度依賴性，時間越長，濃度越高，Kasumi-1 細胞中AML1-ETO蛋白量越低；但是HNK并沒有影響AML1-ETO mRNA的表達，說明其對AML1-ETO的調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄之后。我們將HNK加入CHX處理后的Kasumi-1細胞，發(fā)現(xiàn)AML1-ETO蛋白半衰期變短，也說明HNK對AML1-ETO的調(diào)控是在蛋白層面上。

圖3 UbcH8在HNK誘導(dǎo)的AML1-ETO降解中的作用

圖4 HNK在裸鼠Kasumi-1異種移植模型中的抗腫瘤作用

我們又通過基因芯片分析尋找到UbcH8，發(fā)現(xiàn)HNK能增加它的表達，qRT-PCR和Western blot結(jié)果也證明了這一點。UbcH8是一種E2結(jié)合酶，能催化泛素與蛋白底物結(jié)合，使泛素活化，從而導(dǎo)致底物被蛋白酶降解。有文獻報道，UbcH8能介導(dǎo)AML1-ETO蛋白的降解[23]，因此我們猜測UbcH8在HNK降解AML1-ETO過程中起到關(guān)鍵作用。

為了證明UbcH8的作用，我們用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染Kasumi-1細胞，使UbcH8過表達，結(jié)果AML1-ETO蛋白減少；而在穩(wěn)定敲除了UbcH8的Kasumi-1細胞中，即使加入HNK，也不能引起AML1-ETO蛋白表達的下降，說明HNK對AML1-ETO蛋白的降解正是通過UbcH8來介導(dǎo)的。我們猜測，HNK可能是通過泛素-蛋白酶體系來降解AML1-ETO蛋白，UbcH8在其中起關(guān)鍵作用。其具體的作用機制，將是我們后續(xù)實驗的重點。

最后，我們構(gòu)建了異種移植小鼠模型，經(jīng)過HNK處理的小鼠腫瘤體積小于對照組，腫瘤生長速度也下降，從HNK處理的小鼠體內(nèi)獲得的腫瘤中提取蛋白，檢測發(fā)現(xiàn)AML1-ETO蛋白下降，而UbcH8升高。這證明了HNK具有成為臨床治療t（8；21）白血病患者藥物的可能。

已經(jīng)證明消除白血病發(fā)生的起始因素是非常有效的治療策略。例如，用于慢性髓細胞白血病的BCR-ABL的藥物格列衛(wèi)[24]，用于t（15；17）的急性早幼粒細胞白血病中的PML-RARa的全反式維甲 酸[25-26]已經(jīng)在治療白血病中取得了重大的進展。但是，到目前為止還沒有專門針對AML1-ETO融合蛋白的藥物用于臨床治療。作為一種中草藥中提取的天然化合物，HNK能有效地降解AML1-ETO蛋白，有可能為臨床治療t（8；21）白血病提供幫助。