曹焱帆，章可可，張燕妮，湯豐瑜，胡鳳婷，葉青松

（溫州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 干細(xì)胞與組織工程研究所，浙江 溫州 325035）

生物膜是指黏附于組織表面，并包裹在由微生物產(chǎn)生的胞外復(fù)合物中的微生物膜性聚集體[1]。在微生物引起的體內(nèi)感染中，以生物膜形式的感染占比超過80%[2]。生物膜的屏障作用可以阻礙治療藥物進(jìn)入生物膜并作用于微生物，使得生物膜狀態(tài)下的微生物對(duì)抗生素的抗性比浮游微生物提高了近千倍[3]。伴隨著耐藥性問題浮現(xiàn)，抗生素的地位正面臨巨大威脅[4]。去甲亞精胺是一種多胺分子，這種多胺分子在原核和真核生物中普遍存在，是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的一種多胺[5]。早期研究發(fā)現(xiàn)去甲亞精胺在霍亂弧菌生物膜的形成過程中起到促進(jìn)作用[6]。隨后有許多的研究證實(shí)去甲亞精胺能抑制細(xì)菌生物膜形成。但是對(duì)真菌生物膜形成方面的研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)將口腔常見真菌（白色念珠菌）作為研究對(duì)象，探討去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌生物膜形成的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：實(shí)驗(yàn)所用菌株是白色念珠菌（Candida albicans，C.Albicans）SC5314，由溫州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔研究所提供。

1.1.2 儀器和試劑：紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；全波長(zhǎng)微孔板讀數(shù)板機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司)；體式顯微鏡（日本Nikon公司）；高真空離子濺射儀（瑞士Leica公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM；日本Hitachi公司）；定量PCR儀器（美國(guó)Life Technologies公司）；去甲亞精胺（美國(guó)Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；甲基四氮鹽（XTT，美國(guó)Life Technologies公司）；4-丙磺酸基嗎啉（MOPS）、結(jié)晶紫染色劑、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、PBS（北京Solarbio公司）；甲基丙烯酸樹脂（上海張江生物材料有限公司）；50%戊二醛（北京百靈威科技有限公司）；TRIzol（美國(guó)Thermo Fisher公司)；反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR相關(guān)試劑（大連TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)晶紫染色：梯度稀釋的去甲亞精胺和白色念珠菌懸液共同培養(yǎng)，觀察生物膜量的形成。去甲亞精胺溶液在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)對(duì)倍稀釋，設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組，使其最終濃度范圍為3.5～893.6 mmol/L。 0 mmol/L去甲亞精胺的RPMI1640培養(yǎng)基[7]作為對(duì)照組1；80.0 μmol/L氟康唑的RPMI培養(yǎng)基用作對(duì)照組2[8]；13.4 mmol/L無水乙醇（氟康唑溶劑）的RPMI1640培養(yǎng)基用作對(duì)照組3。加入100 μL 1×105菌落形成單位（colony-forming units，CFU）/mL的白色念珠菌[9]，并補(bǔ)齊至200 μL，在恒溫培養(yǎng)箱中放置48 h，觀察生物膜的形成情況。小心移除孔板內(nèi)液體培養(yǎng)基，用無菌PBS沖洗3次。加入100 μL甲醇溶液固定樣品，15 min后移除甲醇。用去離子水沖洗，風(fēng)干，加入100 μL 0.1%（w/v）結(jié)晶紫染色劑，室溫下浸染，30 min后移除結(jié)晶紫染液，用去離子水沖洗3次。體式顯微鏡觀察孔板底部白色念珠菌生物膜的形成情況。在完成結(jié)晶紫染色的孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入150 μL 33%濃度的醋酸溶液脫色 5 min[10]。用移液槍反復(fù)吹打并吸取100 μL混合液至新的孔板內(nèi)，使用全波長(zhǎng)微孔板讀板機(jī)進(jìn)行讀數(shù)，波長(zhǎng)設(shè)定為590 nm。重復(fù)3次并取平均值。

1.2.2 生物膜代謝活性檢測(cè)：將維生素K3溶于丙酮配制成10 mmol/L的維生素K3母液，備用。將XTT粉末和無菌磷酸鹽溶液以0.5 mg/mL的濃度制成XTT溶液[11]。將XTT溶液與維生素K3母液以體積比為10 000:1混合以制備XTT工作液。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板將梯度稀釋的去甲亞精胺和白色念珠菌以及對(duì)照組1、對(duì)照組2、對(duì)照組3在37 ℃下培養(yǎng)48 h。移除上清液，PBS輕輕沖洗清除殘留浮游細(xì)菌。每孔加100 μL XTT工作液，在37 ℃培養(yǎng)1 h。用移液槍小心將上清液移入新的孔板，使用全波長(zhǎng)微孔板讀板機(jī)進(jìn)行讀數(shù)，波長(zhǎng)設(shè)定為490 nm。重復(fù)3次并取平均值。

1.2.3 菌落計(jì)數(shù)：通過收集實(shí)驗(yàn)組以及對(duì)照組孔板底部生物膜，并對(duì)其進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，檢查對(duì)白色念珠菌生物量的影響。實(shí)驗(yàn)組及生物膜培養(yǎng)方法與上述相同。收集各組生物膜。充分震蕩，保證生物膜的完全分離。不同組的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，作為工作菌液溶液，取10 μL溶液滴在沙氏瓊脂固體培養(yǎng)基上均勻涂布，并在37 ℃下培養(yǎng)24 h，并進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)[12]。重復(fù)3次并取平均值。

1.2.4 SEM成像：將制備好的1 cm×1 cm的甲基丙烯酸樹脂片放置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板底部，使白色念珠菌在義齒基托樹脂片上形成生物膜。PBS沖洗去除殘留培養(yǎng)基和浮游細(xì)菌，1 mL 2.5%終濃度的戊二醛固定樣品，并在室溫下靜置2～16 h。PBS洗滌2次，依次用濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的梯度乙醇脫水15 min[13]，在無水乙醇中可短暫保存。移除無水乙醇，將樣品放置于37 ℃烘箱12 h，進(jìn)行干燥。用高真空離子濺射儀對(duì)樣品表面進(jìn)行25 s鍍膜后，在場(chǎng)發(fā)射SEM觀察白色念珠菌的形態(tài)和生物膜的量。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量qRT-PCR：使白色念珠菌在0 mmol/L、 14.0 mmol/L和27.9 mmol/L濃度的去甲亞精胺環(huán)境下在甲基丙烯酸樹脂片上形成生物膜。在37 ℃下培養(yǎng)48 h后，用滅菌的探針將生物膜刮下來。通過離心收集生物膜。玻璃磁珠破壁并使用TRIzol提取RNA。采用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的純度和濃度，并使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。使用大連TaKaRa公司試劑盒（操作方法參考使用說明書）將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反應(yīng)條件設(shè)定為42 ℃，2 min，在4 ℃冰箱中保存。PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL，分別是熒光染料（SYBR Premix Ex TaqII）10 μL，上游引物（PCR Forward Primer）0.8 μL，下游引物（PCR Reverse Primer）0.8 μL，參比染料（ROX Reference DyeII）0.4 μL，引物模板2 μL和滅菌蒸餾水6 μL。反應(yīng)程序如下：在95 ℃預(yù)變性30 s，在95 ℃變性5 s，在55 ℃退火30 s，在72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)基因組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果使用2-△△CT分析法分析數(shù)據(jù)[14]。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行3次，使用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)晶紫定性分析 結(jié)果顯示，與0 mmol/L去甲亞精胺的RPMI1640培養(yǎng)基的對(duì)照組1（見圖1a）對(duì)比，111.7 mmol/L及以上濃度的去甲亞精胺作用下，白色念珠菌生物膜幾乎不能形成（見圖1b-e)。55.9 mmol/L 去甲亞精胺作用下，在孔板底部仍有較薄的生物膜形成（見圖1f）。而27.9 mmol/L及以下濃度的去甲亞精胺則完全無法抑制生物膜的形成（見圖1g-j）。含有80.0 μmol/L的氟康唑?qū)φ战M2孔板底部可見較薄的生物膜形成（見圖1k），含有13.4 mmol/L無水乙醇（氟康唑溶劑）的RPMI1640培養(yǎng)基的對(duì)照組3不能抑制生物膜形成（見圖1l）。

圖1 結(jié)晶紫染色定性分析去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響

2.2 結(jié)晶紫定量分析 通過對(duì)上述定性染色結(jié)果進(jìn)行脫色溶解并檢測(cè)其吸光度發(fā)現(xiàn)，白色念珠生物膜形成的抑制作用與去甲亞精胺濃度呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)濃度≥111.7 mmol/L時(shí)，吸光度值趨近于0（見圖2），表明白色念珠菌幾乎不能形成生物膜。去甲亞精胺濃度為111.7 mmol/L的實(shí)驗(yàn)組的吸光度值低于80.0 μmol/L的氟康唑（對(duì)照組2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)去甲亞精胺濃度≤ 55.9 mmol/L時(shí)，白色念珠菌形成生物膜的能力隨藥物濃度降低而增強(qiáng)（P＜0.05）。0 mmol/L去甲亞精胺的RPMI1640培養(yǎng)基（對(duì)照組1）和13.4 mmol/L無水乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基（對(duì)照組3）無抑制作用，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 結(jié)晶紫染色定量分析去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌生物膜形成的影響

圖3 XTT定量分析去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌生物膜代謝活性的影響

2.3 XTT檢測(cè) 去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌生物膜代謝活性作用的結(jié)果見圖3。111.7 mmol/L及以上濃度的去甲亞精胺的實(shí)驗(yàn)組中，白色念珠菌的生物代謝活性趨近于0。去甲亞精胺濃度為111.7 mmol/L的實(shí)驗(yàn)組，生物膜代謝活性低于80.0 μmol/L氟康唑（對(duì)照組2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 不同濃度去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌CFU計(jì)數(shù)的影響

2.4 CFU計(jì)數(shù) 去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌生物量的影響見圖4。與不含有去甲亞精胺的RPMI1640培養(yǎng)基（對(duì)照組1）比較，111.7 mmol/L的去甲亞精胺能基本殺滅白色念珠菌，并且與80.0 μmol/L的氟康唑（對(duì)照組2）對(duì)比，更好地減少白色念珠菌的生物量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)去甲亞精胺濃度≤55.9 mmol/L時(shí)，白色念珠菌生物膜中的生物量隨著藥物濃度的降低而升高。含有13.4 mmol/L 無水乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基（對(duì)照組3）則對(duì)白色念珠菌基本沒有殺菌作用。

2.5 生物膜SEM觀察 在0 mmol/L去甲亞精胺的RPMI1640培養(yǎng)基（對(duì)照組1）和13.4 mmol/L無水乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基（對(duì)照組3）共同培養(yǎng)的義齒基托樹脂片上可見菌絲相真菌交織形成較厚的生物膜（見圖5A、C）。加入111.7 mmol/L的去甲亞精胺時(shí)，義齒基托樹脂上僅可見少量極其稀疏的酵母相白色念珠菌（見圖5D）。當(dāng)去甲亞精胺的濃度≤55.9 mmol/L 時(shí)，白色念珠菌生物膜隨著藥物濃度的降低而變厚，且真菌形態(tài)逐漸由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變（見圖5E-G）。含有80.0 μmol/L的氟康唑（對(duì)照組2）義齒基托樹脂片上可見少量菌絲相和酵母相的真菌形成的菌落（見圖5B）。

2.6 實(shí)時(shí)定量qRT-PCR 由于生物膜量的收集問題，實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)27.9 mmol/L和14.0 mmol/L濃度的去甲亞精胺和0 mmol/L去甲亞精胺的對(duì)照組1的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖6）。通過對(duì)目的基因hwp、als3和ywp的擴(kuò)增所得的ct值與內(nèi)參基因18S rRNA對(duì)比。當(dāng)去甲亞精胺的濃度為27.9 mmol/L時(shí)，白色念珠菌黏附相關(guān)的als3、chs1和菌絲相表達(dá)相關(guān)的hwp均處于較低的表達(dá)水平，顯著低于對(duì)照組1和14.0 mmol/L去甲亞精胺的實(shí)驗(yàn)組的基因表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)去甲亞精胺的濃度為14.0 mmol/L時(shí)，hwp和als3基因表達(dá)水平仍明顯低于對(duì)照組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但csh1基因表達(dá)水平明顯升高，稍高于對(duì)照組1，且與27.9 mmol/L去甲亞精胺組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

白色念珠菌是人體常見的共生真菌之一，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，白色念珠菌可引起口腔和陰道黏膜疾病和全身性疾病[15-16]。白色念珠菌也是義齒性口炎的主要致病真菌。有研究表明，去甲亞精胺對(duì)沙門氏菌、變異鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌細(xì)菌生物膜的形成均有不同程度的抑制[17]。本實(shí)驗(yàn)研究了去甲亞精胺對(duì)常見致病真菌白色念珠菌生物膜形成的作用，結(jié)果表明去甲亞精胺能顯著抑制白色念珠菌生物膜的形成且能抑制白色念珠菌毒力相關(guān)基因的表達(dá)。

圖5 SEM觀察去甲亞精胺和氟康唑?qū)ι锬ば纬傻淖饔茫ā? 000）

圖6 0、27.9和14.0 mmol/L去甲亞精胺對(duì)白色念珠菌hwp、als3和csh基因相對(duì)表達(dá)量的影響

結(jié)晶紫、XTT、CFU計(jì)數(shù)和SEM的結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的去甲亞精胺可抑制白色念珠菌生物膜形成，降低白色念珠菌代謝活性，減少生物膜的生物量。研究表明去甲亞精胺可通過調(diào)節(jié)生物膜的pH值、CO2[18]和促進(jìn)胞外多糖離散[19]等機(jī)制抑制細(xì)菌生物膜的形成。去甲亞精胺對(duì)抑制白色念珠菌生物膜形成的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

SEM觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)去甲亞精胺的濃度≥55.9 mmol/L時(shí)，白色念珠菌主要以酵母相的形態(tài)存在；當(dāng)去甲亞精胺的濃度≤27.9 mmol/L時(shí)，抑制生物膜形成的作用減弱，酵母相白色念珠菌數(shù)量明顯高于菌絲相白色念珠菌。菌絲相和酵母相是白色念珠菌2種不同的存在形態(tài)。菌絲相比酵母相具有更強(qiáng)的黏附、入侵宿主細(xì)胞和引起炎癥等能力[20]。白色念珠菌在體外條件下通常以酵母相的形態(tài)存在，環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)、pH值、細(xì)胞表面的接觸感應(yīng)和黏附相關(guān)蛋白的分泌可促進(jìn)白色念珠菌從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，去甲亞精胺能明顯降低白色念珠菌als3、csh1和hwp基因的表達(dá)水平。hwp與白色念珠菌絲相形成相關(guān)，als3與黏附相關(guān)，csh1與疏水性表達(dá)相關(guān)[22]。結(jié)合SEM的結(jié)果，去甲亞精胺通過降低黏附相關(guān)基因的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，從而起到抑制生物膜形成的作用，并且通過抑制真菌由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)換，降低白色念珠菌的致病性。值得關(guān)注的是當(dāng)去甲亞精胺的濃度為14.0 mmol/L 時(shí)，其對(duì)生物膜形成沒有明顯的抑制作用，PCR結(jié)果顯示與白色念珠菌黏附相關(guān)的基因chs1表達(dá)水平較高，且高于對(duì)照組1。通過SEM可以發(fā)現(xiàn)，真菌生物膜表面有較多細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，csh1基因表達(dá)升高，造成黏附相關(guān)蛋白升高，引起真菌向菌絲相形態(tài)轉(zhuǎn)換。這在生物膜的形成中是否起到?jīng)Q定作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明適當(dāng)濃度的去甲亞精胺不僅能有效抑制白色念珠菌生物膜的形成，且能顯著降低白色念珠菌致病毒力相關(guān)基因表達(dá)的水平。去甲亞精胺可能是一種潛在的抗真菌藥物，但是對(duì)于真菌是否會(huì)對(duì)其產(chǎn)生耐藥性及其生物安全性問題，仍需進(jìn)一步研究。