朱麗青，張海月，羅莎莎，方薇薇，劉斯奇，蘇看看，楊麗紅，王明山

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學檢驗中心，浙江 溫州 325015）

遺傳性纖維蛋白原缺陷癥（congenital fibrinogen deficiency，CFD）是一種少見的出血性疾病，分為I型和II型2 種類型。I型患者血漿中纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）數(shù)量減少，包括低纖維蛋白原血癥和無纖維蛋白原血癥；II型患者血漿中Fg數(shù)量正常，但出現(xiàn)功能缺陷，主要包括異常纖維蛋白原血癥和異常低纖維蛋白原血癥[1]?；蛲蛔兪菍е翪FD的分子基礎，可發(fā)生于Fg Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈，突變類型包括錯義突變、移碼突變、無義突變及大片段缺失等[2]。本研究對1例遺傳性低纖維蛋白原血癥進行了表型檢測和基因分析，并且運用Swiss-PdbViewer等生物信息學工具對突變進行預測分析，初步探討引起遺傳性低纖維蛋白原血癥的機制。

1 對象和方法

1.1 對象

1.1.1 病例資料：先證者，女，30歲，此次因乳腺小葉增生來溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診。術前常規(guī)凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和凝血酶時間（thrombin time，TT）輕度延長，纖維蛋白原活性（fibrinogen activity，F(xiàn)g:C）和血漿纖維蛋白原的抗原（fibrinogen antigen，F(xiàn)g:Ag）明顯降低，分別為0.82 g/L和1.19 g/L，其他凝血指標均無明顯異常，肝腎功能正常?；颊邿o訴鼻衄、出血難止、自發(fā)性出血等癥狀，亦無血栓病史。該家系的系譜圖見圖1。

圖1 遺傳性低纖維蛋白原血癥家系圖

1.1.2 正常對照：選取我院體檢中心150名健康體檢者為正常對照，用以排除基因多態(tài)性。其中男78名，女72名，年齡26～59（38.6±24.8）歲。健康對照確認無肝腎功能疾病，無出血與血栓史，采樣前均已知情同意。

1.2 方法

1.2.1 儀器：STA-R全自動凝血功能分析儀（法國STAGO公司）、Beckman Coulter LX20PRO全自動生化分析儀（美國Beckman公司）、PCR擴增儀（ABI Thermal cycler 2720，美國ABI公司）、凝膠電泳儀（上海BIO-RAD公司）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2.2 引物：共包括29對引物（由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科王學鋒教授饋贈）[3]，覆蓋了纖維蛋白原基因FGA、FGB、FGG所有外顯子及側翼序列和啟動子區(qū)，其基因序列分別為：GenBank M64982、M64983、M10014。

1.2.3 試劑：常規(guī)凝血項目試劑盒為法國STAGO公司原裝配套試劑，F(xiàn)g:Ag檢測試劑盒購自浙江伊利康生物技術有限公司，血液基因組DNA提取試劑盒及PCR擴增試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2.4 樣本采集：本研究已通過本院倫理委員會批準，并已簽訂先證者及其家系成員的知情同意書。共采集該家系2代6名成員及正常對照組的外周血標本，用109 mmol/L枸櫞酸鈉以1:9抗凝，3 000 r/min離心10 min后，上層血漿于2 h內(nèi)進行凝血指標檢測；下層血細胞-40 ℃凍存，用于DNA抽提。

1.2.5 凝血項目分析：在Stago-R全自動血凝儀上檢測活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、PT、TT、Fg:C、D-二聚體（D-dimer，D-D）和纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物 （fibrinogen degradation product，F(xiàn)DP）；Beckman Coulter LX20全自動生化分析儀上檢測Fg:Ag。

1.2.6 Fg突變位點篩查：用全血DNA抽提試劑盒提取先證者及其家系成員外周血DNA。PCR法擴增先證者FGA、FGB、FGG基因所有外顯子及側翼序列和啟動子區(qū)。PCR反應總體積為50 μL，包括PCR Master Mix 25 μL、雙蒸水18 μL、DNA模板3 μL和上下游引物各2 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃ 30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min； 30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海桑尼生物科技有限公司測序分析（所用測序儀為ABI PRISM 3730）。測序結果用Chromas軟件與GeneBank中的相應序列進行比對（M64982、M64983、M10014），并對150名健康對照者進行該位點檢測，以排除基因多態(tài)性的可能。

1.2.7 生物信息學分析：基于已知的Fg結構模型（http://www.rcsb.org/pdb，PDB ID:1FZA），分別用Swiss-PDViewer、在線分析系統(tǒng)（http://www.uniprot.org/align）對突變蛋白的結構、突變位點的保守性進行預測分析。

2 結果

2.1 凝血指標檢測 先證者PT和TT均輕度延長，F(xiàn)g:C和Fg:Ag明顯降低。先證者父親和兒子的Fg:C和Fg:Ag也均有不同程度降低，TT也延長，他們的D-D和FDP均在正常范圍；其他家系成員的Fg:C、Fg:Ag及相關凝血指標均在正常范圍（見表1）。

2.2 基因檢測 先證者FGB基因發(fā)現(xiàn)第3外顯子存在c.425T＞G雜合突變（見圖2），導致Fg第121位亮氨酸被替換為精氨酸（Leu121Arg）。通過分析其家系成員，發(fā)現(xiàn)其父親和兒子FGB基因也攜帶有c.425T＞G雜合突變。針對該突變位點，我們對150名健康體檢者的相應位點進行篩查，均未發(fā)現(xiàn)該突變，排除了基因多態(tài)性的可能性。檢索突變數(shù)據(jù)庫（http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen）及查閱文獻顯示：該突變類型為國際上尚未見報道的新突變。

表1 先證者及其家系成員凝血指標及表型檢測結果

圖2 纖維蛋白原FGB 基因第3外顯子的測序結果

2.3 Fg Leu121Arg突變蛋白的模型預測分析 Leu121 位于FgBβ鏈三股螺旋的初始部位，緊挨著卷曲螺旋結構域，為非極性疏水氨基酸，當突變?yōu)锳rg后，改變了氨基酸的極性。Swiss-PDViewer模型預測分析發(fā)現(xiàn)，當Leu121突變?yōu)锳rg后，在Arg121和Try117、Met118、Trp125之間新增了氫鍵（見圖3）。ClustalX-2.1-win軟件蛋白同源性分析發(fā)現(xiàn)：Leu121在小鼠、人類、黑猩猩、犬、牛等多種脊椎動物間有較高的保守性（見表2）。

3 討論

圖3 Leu121Arg突變模型分析

Fg又稱為凝血因子I，由Aα、Bβ、γ 3條多肽鏈構成，是血漿中含量最高的凝血因子，在凝血和止血過程中均起到了非常重要的作用。Fg的3條多肽鏈以對稱性二聚體（Aα、Bβ、γ）2的形式存在，分別由FGA、FGB、FGG3個獨立的基因編碼[4]。這3個基因的缺陷可導致Fg含量或（和）功能異常，分別導致遺傳性無纖維蛋白原血癥、遺傳性低纖維蛋白原血癥、遺傳性異常纖維蛋白原血癥及遺傳性異常低纖維蛋白原血癥[5]。目前已報道的位于Fg基因（FGA、FGB和FGG）的突變類型共有300余種，包括錯義突變、無義突變、剪切突變以及移碼突變。這些突變主要發(fā)生在Aα鏈上，其次為γ鏈，而Bβ鏈最為少見。查閱突變數(shù)據(jù)庫（HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php），到目前為止，發(fā)生在Bβ鏈上的突變類型僅報道有97種，大都位于Bβ鏈的C端[6]。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)1例位于β鏈三股螺旋初始部位的Leu121Arg錯義突變，引起遺傳性低纖維蛋白原血癥：先證者Fg:C和Fg:Ag分別為0.82 g/L和1.19 g/L，其父親和兒子的Fg:C和Fg:Ag也明顯降低。基因分析發(fā)現(xiàn)：他們在FGB基因第3外顯子的425位均有T＞G雜合突變，導致Leu121Arg錯義突變。蛋白同源性分析顯示：Leu121在脊椎動物中有較高的保守性，提示該位點對于Fg正常結構和功能非常重要。Leu121Arg突變，有可能影響了Fg的結構，導致蛋白穩(wěn)定性下降。此外，PDViewer蛋白預測分析軟件發(fā)現(xiàn)：非極性疏水氨基酸Leu121突變?yōu)闃O性氨基酸Arg121，一方面改變了氨基酸的疏水性；另一方面，導致Arg121和Try117、Met118、Trp125之間新增了氫鍵。因而，該突變有可能影響了突變蛋白的二級結構，導致其折疊、構象及穩(wěn)定性改變，引起血漿Fg水平降低。

查閱文獻和檢索Fg基因突變數(shù)據(jù)庫（http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen）發(fā)現(xiàn)，Leu121Arg為首次發(fā)現(xiàn)的新突變。Leu121位于Fg Bβ鏈三股螺旋的初始部位，緊挨Bβ鏈的卷曲螺旋結構域。以往研究表明：Bβ鏈的合成被認為是Fg合成組裝的限速步驟[6-7]。其中，卷曲螺旋結構域對于Fg Aα、Bβ、γ鏈的正常組裝至關重要[8]；而C端則與Fg分泌密切相關[6]。HANSS等[9]曾報道1例由Fg Met118Lys突變引起的低纖維蛋白原血癥，該突變因為改變了氨基酸極性，導致Fg分子構像發(fā)生改變，先證者伴有出血表現(xiàn)及流產(chǎn)病史。Leu121鄰近Met118，兩者均位于Bβ鏈毗鄰卷曲螺旋結構域的區(qū)域，因此，我們推測，Leu121Arg突變也有可能通過影響該結構域的穩(wěn)定性，導致Fg的組裝異常，引起低纖維蛋白原血癥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一個位于B β 鏈Leu121Arg錯義突變引起的遺傳性低纖維蛋白原血癥家系，該突變可能通過改變氨基酸極性，影響氫鍵形成等影響突變體的穩(wěn)定性，導致遺傳性低纖維蛋白原血癥。其具體機制有待進一步的體外表達研究。

表2 蛋白同源性分析結果