張學(xué)銘，陳俊豪，陳雷，李曉航，汪開誠，林瓊瓊，金可可

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2.University of Western Australia，Perth WA6009；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325015；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325027）

骨缺損、骨不愈是臨床上常見的骨科難治性疾病，近年來骨組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展為骨缺損的治療提供了新的方法和理念，其基本原理是制備優(yōu)良的支架材料以搭載合適的種子細(xì)胞及生物因子，完成目標(biāo)區(qū)域的功能重建[1]。骨膜具有較強(qiáng)的成骨能力，在骨折愈合修復(fù)方面具有重要作用，被認(rèn)為是促進(jìn)骨移植材料在移植區(qū)域發(fā)揮修復(fù)作用的始動(dòng)因素[2]。骨膜去細(xì)胞生物支架去除了具有免疫源性的細(xì)胞成分并基本保留了細(xì)胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)和重要組分，在異體皮下包埋實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出了良好的生物相容性[3]。研究表明支架材料是誘導(dǎo)種子細(xì)胞黏附、增殖、分化并維持功能的重要載體，其血管化是實(shí)現(xiàn)組織工程體外培養(yǎng)構(gòu)建與體內(nèi)移植的重要途徑，是去細(xì)胞骨膜支架發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵因素[4-5]。目前對(duì)于骨膜去細(xì)胞生物支架的血管化研究國內(nèi)外罕見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)觀察去細(xì)胞骨膜支架在小鼠股骨缺損模型中血管形成的作用及其對(duì)骨缺損的修復(fù)效果，并探討其血管化的機(jī)制，以期為后續(xù)該支架應(yīng)用于治療骨缺損、骨不愈提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6周齡雄性C57BL/6小鼠64只，體質(zhì)量（23±3）g；健康4月齡雄性新西蘭白兔30只，體質(zhì)量（2.00±0.25）kg，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、脫氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I，DNase 1，美國Sigma公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、青霉素、鏈霉素（美國Sigma公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC，上海博谷生物科技有限公司）；Cell Counting Kit-8試劑盒（日本Dojindo公司）；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）IgG（美國Abcam公司）；山羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Epoch 微孔板分光光度計(jì)（美國BioTek公司）；Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 去細(xì)胞骨膜支架的制備 將游離的兔脛骨骨膜在-80 ℃下冷凍24 h后放于37.5 ℃水浴鍋中1 h，往復(fù)5個(gè)循環(huán)；取出骨膜放入1% Triton-X100 和0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的脫細(xì)胞液中置于37 ℃恒溫震蕩機(jī)上震蕩12 h，PBS反復(fù)沖洗；放入1% SDS中繼續(xù)震蕩2 h；沖洗后將骨膜放于混有50 U/mL DNase 1酶消化酶液中30 min后，浸泡于0.1%過氧乙酸溶液消毒1 h，PBS充分沖洗后置于含100 U/mL的青、鏈霉素的PBS液中4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 支架浸提液的制備及VEGF測定 完全DMEM培養(yǎng)基浸泡支架72 h獲得支架浸提液，用于VEGF測定。參照試劑盒說明書用ELISA法檢測支架浸提液中VEGF水平。

1.5 骨膜去細(xì)胞支架浸提液細(xì)胞毒性檢驗(yàn) 采用CCK-8法檢測骨膜去細(xì)胞支架浸提液對(duì)骨膜細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞分為正常對(duì)照組和支架浸提液組。正常對(duì)照組中加入DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL鏈霉素）]；支架浸提液組加入等量含10%胎牛血清和抗生素（100 U/mL青霉素G和0.1 mg/mL鏈霉素）的支架浸提液。將HUVEC分別以5×103細(xì)胞/孔和10×103細(xì) 胞/孔的濃度接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。分別在第2天和第5天，用酶標(biāo)儀在450 nm下測量細(xì)胞的吸光度，以上每組樣本檢測8個(gè)孔。

1.6 支架浸提液對(duì)HUVEC遷移的影響 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察HUVEC遷移。實(shí)驗(yàn)分為3組：①正常對(duì)照組；②支架浸提液組；③bFGF陽性對(duì)照組。正常對(duì)照組加入完全DMEM培養(yǎng)基，支架浸提液組加入等量的支架浸提液，陽性對(duì)照組中加入等量含5 ng/mL bFGF的DMEM培養(yǎng)基。HUVEC以5×105細(xì)胞/孔的濃度種在六孔板中，在含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃過夜。使用滅菌的黃色槍頭在孔板底部，垂直水平線劃出痕跡，用PBS輕柔沖洗干凈，將六孔板放入含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱在37 ℃孵育24 h。在0、12、24 h 拍攝照片，并使用ImageJ軟件計(jì)算各組細(xì)胞的遷移面積。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)將C57BL/6 小鼠分為對(duì)照組（n=16）和支架組（n=48）。使用1.5%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠（0.1 mL/20 g）；用4G針頭在小鼠股骨遠(yuǎn)端上制作直徑0.5 mm的孔狀單皮質(zhì)缺損；將去細(xì)胞骨膜支架用打孔器制成直徑5 mm的圓片，并消毒備用。對(duì)照組小鼠在孔狀骨缺損制備完畢后，不放置任何材料，直接縫合肌肉和皮膚；支架組中，將消毒好的骨膜支架放置在股骨缺損處，適當(dāng)固定后，縫合肌肉和皮膚。分別在第7天、第14天、第21天和第28天處死動(dòng)物，取出股骨，4%多聚甲醛固定；37 ℃下用含12.5%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脫鈣溶液脫鈣。最后將骨膜支架進(jìn)行石蠟包埋，切片備用。

1.8 去細(xì)胞骨膜支架的血管化觀察 通過HE染色觀察骨缺損區(qū)域和支架的修復(fù)情況。免疫熒光染色法觀察血管上的vWF。實(shí)驗(yàn)步驟如下：石蠟切片厚度5 μm，常規(guī)脫蠟至水，并進(jìn)行抗原修復(fù)；加入兔抗vWF抗體（1:100），4 ℃過夜；加入熒光標(biāo)記的二抗抗體，37 ℃濕盒避光孵育30 min；4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）復(fù)染10 min，PBS沖洗5 min；甘油緩沖液封片；熒光顯微鏡下觀察，胞核呈藍(lán)色熒光，vWF的表達(dá)為綠色熒光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表 示。組間比較采用單因素方差分析，多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊者行Duunet’s檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架浸提液的細(xì)胞毒性 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在第2天和第5天，2種細(xì)胞濃度的支架浸提液組和正常對(duì)照組的OD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8）

2.2 支架中VEGF的濃度 ELISA法檢測結(jié)果顯示，支架浸提液中的VEGF濃度為（210.75±4.81）pg/mL，高于正常對(duì)照組（完全DMEM培養(yǎng)基）的（21.00± 6.37）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示支架浸提液組細(xì)胞的遷移面積大于正常對(duì)照組，但小于bFGF陽性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 支架的血管化觀察

2.4.1 HE染色：去細(xì)胞骨膜支架植入體內(nèi)7 d后，支架中有血管出現(xiàn)（見圖3）；在第14天，支架內(nèi)血管明顯增多；第21天時(shí)，支架中血管密度達(dá)到最大，血管內(nèi)可見少量紅細(xì)胞；第28天時(shí)，血管密度較第21天有所下降。

2.4.2 免疫熒光染色：第7天的支架內(nèi)出現(xiàn)綠色環(huán)狀熒光，數(shù)量較少；第14天，熒光量有所增加，且較局部分散；第21天，熒光量明顯增加，并且分布較均勻；第28天，熒光量較第21天時(shí)有所減少。提示支架內(nèi)血管生長呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)，并于第21天的時(shí)間段內(nèi)達(dá)到最高水平（見圖3）。

圖3 支架的HE染色和免疫熒光染色（比例尺：50 μm）

2.5 骨缺損區(qū)域的修復(fù)情況 第7天，支架組骨缺損處觀察到肉芽組織和血管。在對(duì)照組中，骨缺損處僅觀察到纖維結(jié)締組織，未觀察到血管。第14天，支架組骨缺損處血管密度增加，并且出現(xiàn)骨樣礦化；對(duì)照組骨缺損處開始出現(xiàn)肉芽組織和血管。第21天，支架覆蓋的缺損處編織骨形成，出現(xiàn)骨樣結(jié)構(gòu)，對(duì)照組可觀察到骨樣礦化，但沒有編織骨形成。在第28 天，支架組骨缺損處皮質(zhì)骨完整包裹缺損處，骨纖維排列較規(guī)則，骨缺損的愈合較完整，對(duì)照組可觀察到骨樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則。見圖4。

3 討論

圖4 骨缺損處的HE染色（比例尺：100 μm）

本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去細(xì)胞骨膜支架對(duì)HUVEC的增殖沒有抑制作用，并且可以促進(jìn)HUVEC的遷移，但是促遷移效果不如bFGF明顯。bFGF可以促進(jìn)HUVEC遷移[6]，故本實(shí)驗(yàn)中使用bFGF作為陽性對(duì)照組。有實(shí)驗(yàn)研究[7-8]將支架與bFGF結(jié)合來促進(jìn)支架生理功能的恢復(fù)，并取得了良好的效果。在后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究中，可以將bFGF和去細(xì)胞骨膜支架相結(jié)合，來增強(qiáng)支架的血管化，促進(jìn)其修復(fù)能力的恢復(fù)。通過HE染色，我們觀察到支架中血管的數(shù)量和分布隨時(shí)間而呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化。支架內(nèi)血管數(shù)量隨著在體內(nèi)時(shí)間的延長呈先增多后減少的趨勢(shì)，在第3周時(shí)支架內(nèi)血管密度達(dá)到最大，血管分布也更加均勻。vWF是一種黏著性多聚糖蛋白，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面[9]，故本實(shí)驗(yàn)通過vWF特異性熒光染色來進(jìn)一步鑒定支架中的血管生成情況。免疫熒光檢測到vWF的密度變化與HE染色中血管密度的變化呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。去細(xì)胞骨膜支架中血管在后期減少提示支架在體內(nèi)完成修復(fù)作用后，可能會(huì)逐步降解。在去細(xì)胞肌腱[10]和去細(xì)胞腎支架[11]的研究中均觀察到支架降解過程，其具體降解機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究觀察。在骨膜支架的浸提液中檢測到VEGF，提示支架的血管化機(jī)制可能是VEGF的刺激作用。VEGF在血管的生成和生長中起關(guān)鍵作 用[12]，其可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、分化和運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)血管的增多和生長[13]，并有研究表明，其可以增強(qiáng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白的誘導(dǎo)作用，促進(jìn)新生骨的形成[14]。

通過4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)支架組和對(duì)照組的小鼠骨缺損區(qū)域的修復(fù)情況的對(duì)比觀察，我們發(fā)現(xiàn)支架組小鼠的骨缺損處能夠在更短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)血管，并長出排列規(guī)則的皮質(zhì)骨。支架對(duì)骨缺損的修復(fù)作用，一方面是因?yàn)橹Ъ鼙旧韺?duì)缺損區(qū)域的覆蓋保護(hù)作用，另一方面可能是支架內(nèi)血管為骨缺損的修復(fù)提供了良好的氧和營養(yǎng)供應(yīng)，并促進(jìn)骨缺損區(qū)域的血管生成。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明去細(xì)胞骨膜支架可以血管化，并促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，其血管化的關(guān)鍵因素可能是VEGF。此外，實(shí)驗(yàn)中觀察到支架中血管密度呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)，提示支架在完成修復(fù)功能后可能會(huì)發(fā)生降解，其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究和觀察。