錢倩宇潘然,2常開心田男錢穎杜仲燕李松濤竇曉兵

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江大學(xué)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。近年來在我國的發(fā)病率和死亡率逐步增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。如何有效防治ALD是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)迫切需要解決的問題。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今為止尚無安全有效治療ALD的臨床用藥[2]。因此，更深入地探究ALD發(fā)病過程中的發(fā)病機(jī)制，對臨床上尋求其有效治療方法有著重要而迫切的意義。

近年來，越來越多的研究表明，MicroRNA（miRNA）參與酒精性肝損傷、脂肪肝、肝細(xì)胞癌等慢性肝病的發(fā)病過程[3-4]。Lethal-7（let-7）是目前研究最為廣泛的 miRNA 之一[5]，在人類中，let-7家族由13個(gè)成員組成，并在體細(xì)胞組織和器官中大量表達(dá)[6-7]。研究表明，let-7a通過調(diào)控細(xì)胞自噬抑制癌細(xì)胞增殖[8-11]，而自噬在各種肝臟疾病發(fā)病機(jī)制中同樣扮演著重要的角色[12-13]。ALD患者由于長期過量飲酒會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)自噬水平下調(diào)[14-15]，從而加劇 ALD的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究推測let-7可能通過對自噬的調(diào)節(jié)來調(diào)控ALD及其它相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

lncRNA(long con-coding RNA,lncRNA)是一類位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA[16-22]，廣泛參與細(xì)胞分化、代謝、增殖等過程，并與多種疾病關(guān)系密切。在基因表達(dá)調(diào)控研究中，lncRNA對miRNA的調(diào)控是十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，并進(jìn)而介導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控等幾個(gè)重要的基因表達(dá)模塊[24]。lncRNA可以發(fā)揮內(nèi)源性miRNA“海綿”的功能，或通過與miRNA競爭結(jié)合靶基因以抑制miRNA表達(dá)[25]。因此，本研究探究lncRNA與 let-7 miRNA的潛在作用關(guān)系。

綜上所述，本研究推測lncRNA可能通過調(diào)控let-7 miRNA的表達(dá)，從而影響肝細(xì)胞自噬，進(jìn)而探究lncRNA和 let-7通過調(diào)控自噬在ALD發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制，為 ALD的臨床診斷及治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器 細(xì)胞：人肝細(xì)胞HepG2購自中科院上海細(xì)胞庫。試劑：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，甘油三脂試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，谷胱甘肽（glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,GSSG）試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）試劑盒購自亞諾法生計(jì)股份有限公司。其他實(shí)驗(yàn)試劑均購自Sigma Aldrich公司。儀器：微量紫外分光光度儀（型號(hào)QWell 5000）購自美國Quawell公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)MR-4100）購自美國Dynatech公司，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)5541RB31614）購自德國Beckman公司，二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)HEPA CLASS 1003111）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人肝細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。制備人肝細(xì)胞HepG2單細(xì)胞懸液，細(xì)胞按2×105個(gè)/mL密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1mL，分成2組：①空白對照組（untreated group,UT）：不作任何藥物處理；②模型組：用200 μΜ H2O2處理，過夜處理16h。以上兩組每組設(shè)12個(gè)重復(fù)孔。

1.2.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性檢測 根據(jù)LDH檢測試劑盒說明測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平，分析各組間的細(xì)胞毒性作用。

1.2.3 小鼠ALD模型 使用體質(zhì)量為25±0.5g的雄性C57BL/6小鼠，采用Lieber-DeCarli法建立小鼠ALD模型。分別喂養(yǎng)含酒精的液體飼料（alcohol feeding group,AF組）以及等熱量的對照液體飼料（pair feeding,PF組）喂養(yǎng)5周。每天記錄小鼠進(jìn)食量，每周記錄小鼠體重。經(jīng)過5周的喂食后，將小鼠禁食不禁水5小時(shí)，用戊巴比妥鈉麻醉后通過下腔靜脈采集血樣。取肝臟組織，部分組織4%多聚甲醛固定，固定組織制作石蠟切片，HE染色法觀察肝臟組織病理學(xué)改變，其余組織-80℃保存待用。

1.2.4 測定肝臟損傷及脂肪累積 將血樣4℃下以3000 rpm離心5min制備血漿樣品。通過使用ALT活性測定試劑盒測定血漿ALT水平來評價(jià)肝損傷程度。并且，通過使用甘油三酯(triglyceride,TG)檢測試劑盒測量總肝TG含量和肝臟組織切片的HE染色來檢測肝臟脂肪積累。

1.2.5 測定肝組織及細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG水平及脂質(zhì)過氧化測定 使用GSH和GSSG檢測試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書，定量檢測PF和AF小鼠的肝組織及細(xì)胞模型中的GSH和GSSG比例，來評估過量酒精攝入導(dǎo)致的氧化性肝損傷程度。根據(jù)說明書使用TBARS試劑盒檢測AF和PF小鼠的肝組織TBARS水平，據(jù)此評估肝臟脂質(zhì)過氧化程度。

1.2.6 RNA提取、cDNA合成和Real-time PCR定量檢測let-7及其下游靶基因 使用Trizol法提取肝組織樣品和HepG2細(xì)胞總RNA，使用oligo-(dT)或序列特異性引物進(jìn)行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR擴(kuò)增let-7及其下游靶基因，以18S rRNA為內(nèi)參，cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR測定。

1.2.7 生物信息學(xué)輔助鑒定let-7靶標(biāo)miRNA及l(fā)ncRNA 使用Targetscan和miRanda鑒定了已明確的mRNA-miRNA和miRNA-lncRNA相互作用。為了預(yù)測miRNA結(jié)合位點(diǎn)，從NONCODEv4數(shù)據(jù)庫下載了lncRNA的全長序列?；赥argetScan建立高可信賴miRNA-lncRNA對。為了減少假陽性的數(shù)量，僅包含攜帶至少兩個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA。所有上述相互作用的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長期酒精飲食導(dǎo)致小鼠肝組織損傷和脂肪蓄積結(jié)果表明，與PF組相比，AF組小鼠肝損傷更為顯著，血清ALT水平及肝內(nèi)TG水平均有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外，HE染色結(jié)果也顯示模型組與對照組的小鼠相比肝臟內(nèi)脂滴蓄積明顯增多。見圖1。

圖1 長期酒精飲食導(dǎo)致的小鼠肝組織損傷和脂肪蓄積Fig.1 Liver tissue injury and lipopexia of mice caused by long-term alcohol diet

2.2 過量酒精攝入引起肝臟氧化損傷并抑制let-7基因的表達(dá) 酒精對小鼠肝損傷程度結(jié)果表明，AF組小鼠肝臟GSH/GSSG水平較PF組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，與PF組相比，AF組的總TBARS濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。qRT-PCR結(jié)果表明，與PF組相比，AF組中6個(gè)let-7基因均有明顯下調(diào)，且let-7c、let-7d和let-7g最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。用 200 μM H2O2處理HepG2細(xì)胞，數(shù)據(jù)顯示細(xì)胞中GSH/GSSG比例下降了70%左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與動(dòng)物模型一致，H2O2處理的細(xì)胞中所有6種let-7基因的表達(dá)水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 2。

2.3 過量的酒精攝入會(huì)改變可能與let-7相互作用的自噬相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá) 進(jìn)一步使用Targetscan 6.2和miRanda 3.3a等生物信息學(xué)方法，分析確定了幾種可能是let-7下游靶標(biāo)的自噬相關(guān)標(biāo)志基因，包括beclin、atg1、atg4和LC3B。然后通過qRT-PCR在ALD小鼠模型中檢測其表達(dá)水平。結(jié)果表明，AF組中4種自噬相關(guān)標(biāo)志基因均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明這些自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)可能由于lncRNA與let-7之間相互調(diào)控作用抵消了let-7對以上基因的調(diào)控。見圖3。

圖2 長期酒精攝入后抑制let-7基因表達(dá)Fig.2 Inhibition of let-7 gene expression after long-term alcohol intake

2.4 檢測可能與let-7相互作用的lncRNA表達(dá)運(yùn)用Targetscan 6.2和miRanda 3.3a分析可能與let-7相互作用的lncRNA，并選出其中可能性最高的 3個(gè) lncRNA，分別是 NONMMUT012132、NONMMUT019851和NONMMUT068425。隨后用qRT-PCR定量分析小鼠肝組織中候選lncRNA的表達(dá)水平。與PF組相比，AF組小鼠的NONMMUT012132表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NONMMUT019851和NONMMUT068425表達(dá)水平均有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

肝臟是酒精代謝的主要部位，長期的酒精攝入會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡。已有研究表明miRNA在 ALD發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用。K.Kodys等研究表明，四周含酒精飲食導(dǎo)致七只小鼠miRNA的下調(diào)和兩只小鼠miRNA的上調(diào)[26]。在ALD患者或大鼠ALD模型中也得到了以上結(jié)果[27-28]。Chen等最近研究顯示ALD大鼠肝臟的let-7b水平僅為對照組的39%[28]。然而，let-7家族的其他成員是否參與ALD發(fā)生，且let-7的異常表達(dá)和酒精誘導(dǎo)的肝臟病理變化之間的關(guān)聯(lián)尚不清楚。已有研究表明過量酒精消耗對正常細(xì)胞過程的破壞機(jī)制的主要包括醇脫氫酶途徑，微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)和過氧化氫酶途徑[29]，均與氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有關(guān)。同時(shí)，有證據(jù)表明let-7在減輕肝氧化損傷中的作用[30]。這些研究表明損傷在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ALD的發(fā)生與let-7有關(guān)。本研究的數(shù)據(jù)證實(shí)，至少有六名let-7家族成員在酒精攝入組中被下調(diào)。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)H2O2觸發(fā)的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)let-7表達(dá)的失調(diào)，這表明let-7可能是受酒精影響更大的miRNA家族之一。

圖3 過量的酒精攝入會(huì)改變可能與let-7相互作用的自噬相關(guān)生物標(biāo)志基因表達(dá)Fig.3 Excessive alcohol intake alters the expression of autophagy-associated biomarker genes that may interact with let-7

圖4 與let-7相互作用的lncRNA表達(dá)Fig.4 lncRNA expression interacting with let-7

自噬涉及各種酒精誘導(dǎo)的病理生理學(xué)變化，如線粒體損傷和氧化損傷，已經(jīng)成為ALD和其他酒精性疾病發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵因素。本研究顯示let-7的下游自噬標(biāo)志基因如beclin、Atg1、Atg4和LC3B在酒精攝入組小鼠中均有明顯下調(diào)。雖然酒精攝入和自噬之間的確切關(guān)系非常復(fù)雜，且目前其具體機(jī)制尚不明確，但已有研究表明肝細(xì)胞自噬被慢性酒精消耗抑制[31-33]，本研究結(jié)果顯示酒精引起肝細(xì)胞自噬可能受let7調(diào)控。

本研究推測，let-7對自噬生物標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用可能受到其他非編碼RNA（如lncRNA）的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與let-7家族成員相互作用的3個(gè)候選lncRNA，其表達(dá)在AF處理組中表達(dá)情況有所不同。越來越多的研究表明miRNA和lncRNA之間的調(diào)節(jié)是相互的。一方面，已知lncRNA補(bǔ)充其靶miRNA，導(dǎo)致后者受抑制的mRNA去抑制。另一方面，許多l(xiāng)ncRNA的細(xì)胞豐度由miRNA重復(fù)調(diào)控[34-35]。lncRNA的參與可能為let-7和自噬相關(guān)miRNA的同時(shí)下調(diào)提供了合理的解釋。例如，NONMMUT019851和NONMMUT068425可能會(huì)抑制let-7的監(jiān)管活動(dòng)，因此它們的下調(diào)可能對let-7的降低水平產(chǎn)生補(bǔ)償作用。另一種解釋是，上調(diào)的NONMMUT012132可能與let-7競爭結(jié)合自噬miRNA靶標(biāo)。但具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明，小鼠慢性酒精消耗能誘發(fā)肝細(xì)胞氧化損傷，而lncRNA/let-7在氧化損傷抑制的線粒體自噬過程中可能起重要作用。本研究為以let-7為靶點(diǎn)診斷及治療ALD奠定了初步的試驗(yàn)基礎(chǔ)。