劉耀河，秦 寧，楊 瑜，宋 銳，侯 歌，王 成，郭振江，梁 冰，張 艷，劉宗文

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射治療科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)學(xué)腫瘤內(nèi)科 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道腫瘤，其中超過(guò)90%的病理類(lèi)型都是鱗狀細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)鱗癌)[1-2]。癌細(xì)胞的代謝模式是在氧氣充足的條件下以糖酵解為主并獲取能量，稱(chēng)為 Warburg效應(yīng)，且這一代謝模式的改變會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(monocarboxylate transporter 4, MCT4)是單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員，它的主要功能是將胞內(nèi)的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，這不僅可以維持胞外低酸的微環(huán)境，還可以讓胞內(nèi)糖酵解順利進(jìn)行[3-4]。作為乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的主要參與者，MCT4在食管腺癌和胃癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且影響預(yù)后[5-6]。有研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MCT4的表達(dá)以減少乳酸的外排，可以顯著減弱結(jié)直腸癌和宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)分析了食管鱗癌細(xì)胞和組織中MCT4的表達(dá)，觀察下調(diào)MCT4表達(dá)對(duì)食管鱗癌EC109細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、組織及主要試劑

1.1.1 組織來(lái)源 選取鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科2014至2015年的食管鱗癌組織標(biāo)本60例，另取癌旁正常食管黏膜組織(距癌灶3 cm以外)19例，均經(jīng)病理證實(shí)。患者手術(shù)前均未接受放化療等治療，手術(shù)方式為食管癌根治切除術(shù)。其中男39例，女21例；≥65歲28例，<65歲32例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期30例，Ⅲ+Ⅳ期30例；病理分級(jí)高中分化42例，低分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。

1.1.2 細(xì)胞株 正常食管上皮細(xì)胞Het1-A和食管鱗癌細(xì)胞EC109和EC9706均由鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化研究所捐贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑 鼠抗人單抗MCT4、鼠抗人單抗GAPDH和鼠抗人單抗β-tublin分別購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司、武漢三鷹生物技術(shù)有限公司和Absin公司。Lipofectamine 3000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。靶向MCT4的siRNA(MCT4-siR)和陰性對(duì)照siRNA(NC-siR)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，序列見(jiàn)表1。通用SP免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋有限公司。凝膠制備試劑盒和CCK8 試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó) BD公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。乳酸測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司。

表1 siRNA序列

1.2食管鱗癌組織和細(xì)胞中MCT4蛋白的檢測(cè)

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)組織中MCT4蛋白 將新鮮的組織標(biāo)本于多聚甲醛中脫水固定，過(guò)夜后石蠟包埋，3～5 μm厚切片，然后經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉等步驟，滴加MCT4單抗(稀釋度1∶200)4 ℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對(duì)照。于200倍鏡下觀察，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。于200倍鏡下觀察，選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。按照染色強(qiáng)度評(píng)分：不顯色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：<5%計(jì)0分，5%～計(jì)1分，10%～計(jì)2分，50%～計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。由兩名病理科專(zhuān)家使用雙盲法閱片評(píng)分，當(dāng)兩人結(jié)果不一致時(shí)，請(qǐng)第3位病理科醫(yī)生定奪。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MCT4蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Het1-A、EC109和EC9706細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)/mL接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶洗脫細(xì)胞，PBS洗滌2次，用離心管收集后加入裂解液，冰上裂解30 min，BCA法測(cè)量蛋白濃度。根據(jù)凝膠制備試劑盒說(shuō)明書(shū)配制凝膠，上樣量為25 μg。恒壓90 V30 min后轉(zhuǎn)恒壓120 V，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜75 min。用含有吐溫20和脫脂乳的TBST(pH 7.8)室溫下封閉2 h；加一抗(MCT4抗體稀釋度1∶200，GAPDH抗體稀釋度1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜；加二抗室溫孵育2 h；化學(xué)發(fā)光顯色，暗室曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Image J進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值，以此表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.3下調(diào)MCT4表達(dá)后EC109細(xì)胞生物學(xué)行為的變化

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)/mL接種于6孔板。實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為空白對(duì)照組、NC-siR組和MCT4-siR組，每組3個(gè)復(fù)孔。避光條件下，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，NC-siR組和MCT4-siR組利用lipofectmine3000分別轉(zhuǎn)染NC-siR和MCT4-siR，饑餓轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基。

1.3.2 細(xì)胞中MCT4蛋白的表達(dá) 用胰蛋白酶將各組細(xì)胞洗脫下來(lái)，PBS洗2次，冰上裂解30 min，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，Western blot法檢測(cè)MCT4蛋白，內(nèi)參為β-tublin,方法同前。

1.3.3 細(xì)胞外乳酸含量的測(cè)定 轉(zhuǎn)染72 h后，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,將細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至EP管中，依照乳酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定530 nm處吸光度，按照公式計(jì)算細(xì)胞外乳酸含量。

1.3.4 細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 按照1.3.1方法處理細(xì)胞后，將 3組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔2×103個(gè)，加入100 μL培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，加入10 μL CCK8溶液于37 ℃烘箱中孵育2 h，測(cè)量530 nm處的吸光度(A)。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A/空白對(duì)照組A×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基按照8∶1的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，然后加入到Transwell上層小室(100 μL)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。移除基質(zhì)膠，將細(xì)胞鋪于上層小室中，用含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μL填充小室下層。24 h后，用棉簽擦去上層的細(xì)胞和基質(zhì)，將小室放入無(wú)水甲醇中固定20 min，結(jié)晶紫染色,于400倍鏡下觀察。選取5個(gè)視野拍攝并計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算平均數(shù)。侵襲率=實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 細(xì)胞遷移能力的檢測(cè) 將細(xì)胞按照1.3.1方法分組培養(yǎng)，板中形成完整的單層細(xì)胞后，用200 μL槍頭的尖端在底部畫(huà)一條直線,用PBS清洗，加入2 mL含有體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0和24 h后鏡下拍照，用Image Pro Plus 6.0分析。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。遷移率=實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率/空白對(duì)照組劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。食管正常及癌組織中MCT4高表達(dá)率的比較，不同臨床病理特征癌組織中MCT4高表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)；3種細(xì)胞中MCT4表達(dá)水平的比較，3組細(xì)胞中MCT4表達(dá)水平、細(xì)胞外乳酸含量的比較采用單因素方差分析；NC-siR組和MCT4-siR組細(xì)胞增殖率、遷移率及侵襲率的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌組織中MCT4的表達(dá)食管鱗癌和正常食管黏膜組織中MCT4的表達(dá)見(jiàn)圖1。食管鱗癌組織中MCT4高表達(dá)率為70.0%(42/60)，而正常食管黏膜組織中為26.3%(5/19)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.427，P<0.001)。不同臨床病理特征食管鱗癌組織中MCT4表達(dá)的比較見(jiàn)表2。由表2可知，高中分化癌組織中MCT4高表達(dá)率低于低分化癌組織。

圖1 食管鱗癌(A)和正常食管黏膜(B)組織中MCT4的表達(dá)(SP,×200)

例

續(xù)表1

2.23種細(xì)胞中MCT4蛋白表達(dá)水平的比較見(jiàn)圖2。Het1-A、EC9706和EC109細(xì)胞中MCT4蛋白表達(dá)水平分別為(0.52±0.05)、(0.84±0.04)和(0.92±0.03)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.857，P<0.001)；EC9706和EC109細(xì)胞中MCT4蛋白表達(dá)水平高于Het1-A，且EC109細(xì)胞中MCT4蛋白表達(dá)水平高于EC9706(P<0.05)，故選取EC109用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 3種細(xì)胞中MCT4蛋白的表達(dá)

2.3下調(diào)MCT4后EC109細(xì)胞生物學(xué)行為的變化

2.3.1 3組細(xì)胞中MCT4的表達(dá) 見(jiàn)圖3、表3。與空白對(duì)照組和NC-siR組比較，MCT4-siR組細(xì)胞中MCT4蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。

1：空白對(duì)照組；2：NC-siR組；3：MCT4-siR組

2.3.2 3組胞外乳酸含量及細(xì)胞增殖率、侵襲率、遷移率的比較 圖4和表3?？梢钥闯?，MCT4-siR組胞外乳酸含量較空白對(duì)照組和NC-siR組降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖率、遷移率和侵襲率均較NC-siR組降低(P<0.001)。

A：空白對(duì)照組；B：NC-siR組；C：MCT4-siR組

*:與空白對(duì)照組和NC-siR組相比，P<0.05

3 討論

腫瘤細(xì)胞分泌的乳酸在腫瘤微環(huán)境中持續(xù)大量積累會(huì)反饋性抑制腫瘤細(xì)胞的能量獲取，使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜發(fā)生降解，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力增強(qiáng)[9]。乳酸還可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming growth factor β2，TGF-β2)的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[10]。因此，控制乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)的MCT4與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)關(guān)系密切[3-4]。張寶月等[11]發(fā)現(xiàn)從正常宮頸上皮發(fā)展到宮頸癌的過(guò)程中，組織中MCT4蛋白表達(dá)水平不斷增加。也有文獻(xiàn)[5]報(bào)道在正常食管到巴雷特食管再到食管腺癌發(fā)展過(guò)程中，組織中MCT4蛋白表達(dá)水平呈線性增長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中MCT4蛋白的表達(dá)水平高于正常食管黏膜組織，且癌組織分化程度越低，MCT4蛋白表達(dá)水平越高；食管鱗癌細(xì)胞EC9706和EC109中MCT4蛋白表達(dá)水平高于正常食管黏膜細(xì)胞Het1-A。研究結(jié)果提示，腫瘤細(xì)胞惡性程度增加，MCT4表達(dá)水平也增加，以維持腫瘤細(xì)胞正常的能量代謝。

Voss等[12]利用吖啶黃抑制劑破壞MCT4-CD147的連接后，腫瘤細(xì)胞增殖能力下降，并在體內(nèi)觀察到腫瘤血管生成受抑。氯汞苯磺酸鹽、醋酸鉛和二氯化鎘均可抑制MCT4與CD147的相互作用，造成乳酸外排減少，但是這些化合物有很大的副作用，暫時(shí)還未用于腫瘤治療[13-14]。

利用siRNA下調(diào)口腔鱗癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中 MCT4 的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低[15-16]。運(yùn)用siRNA沉默尿路上皮癌細(xì)胞中的MCT4可造成胞內(nèi)乳酸的聚集，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降[17]，這種增殖抑制作用在高度惡性細(xì)胞中效果更明顯[18]。前列腺癌細(xì)胞的糖酵解能力較強(qiáng)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的乳酸，特異性抑制前列腺癌細(xì)胞中MCT4基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力、糖酵解能力和乳酸分泌能力均顯著降低[19]。下調(diào)宮頸癌Hela和Siha細(xì)胞中MCT4的表達(dá)，可成功抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[8]。

本實(shí)驗(yàn)中我們參考郭振江等[8]設(shè)計(jì)，合成靶向MCT4的siRNA，轉(zhuǎn)染至EC109細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞外乳酸含量降低，同時(shí)細(xì)胞增殖率、遷移率和侵襲率下降；提示沉默MCT4基因可以使EC109細(xì)胞的侵襲和遷移能力變?nèi)?，其作用機(jī)制可能與減少細(xì)胞外乳酸含量有關(guān)，但是具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，MCT4在正常食管上皮進(jìn)展到食管鱗癌過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，下調(diào)其表達(dá)可以降低食管鱗癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。MCT4很可能會(huì)成為一個(gè)食管鱗癌臨床診斷和分子治療的靶點(diǎn)。