王 洋，宋卓悅，連曉磊，李江南，丁 康，李廣恒

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州450052

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎為骨科的常見(jiàn)病和多發(fā)病，發(fā)病原因有高齡、肥胖、外傷、遺傳等。多種細(xì)胞因子代謝紊亂，蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原降解，透明質(zhì)酸減少等原因共同導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細(xì)胞代謝紊亂，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[1-2]。目前尚缺乏有效的途徑來(lái)對(duì)抗軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的丟失和軟骨細(xì)胞的凋亡[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類(lèi)多向分化的干細(xì)胞，具有分化為軟骨細(xì)胞并治療軟骨病損的潛力[4]。研究[5-6]表明多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，如骨骼肌來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial-derived stem cells，SDSCs)、骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞等可以用于膝關(guān)節(jié)早期骨性關(guān)節(jié)炎軟骨病損的治療。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞治療早期骨性關(guān)節(jié)炎已取得了良好效果[7-9]。本研究觀(guān)察了SDSCs及脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、炎性軟骨細(xì)胞(inflammatory chondrocyte，ICs)體外成軟骨分化能力的差異，以尋找更為合適的治療骨性關(guān)節(jié)炎軟骨病損的種子細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源與主要試劑選擇鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科2016年12月至2017年12月行人工膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)的骨性關(guān)節(jié)炎患者，男10例，女10例，取其負(fù)重區(qū)髕下脂肪墊、滑膜組織以及剝離的軟骨進(jìn)行原代培養(yǎng)?；颊呒凹覍倬橥?，實(shí)驗(yàn)已通過(guò)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：81472136)。膠原酶Ⅵ、胰蛋白酶、阿爾新藍(lán)及番紅O試劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；qRT-PCR試劑盒以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自eBioscience公司；山羊血清為北京索萊寶公司產(chǎn)品；Ⅱ型膠原抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(含100 μg/L骨形態(tài)發(fā)生蛋白4和10 μg/L轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3)為L(zhǎng)onza公司產(chǎn)品。

1.2ICs、ADSCs及SDSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定取膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中剝脫的炎性軟骨約1 g，用含青、鏈霉素的組織洗液洗滌5～8次，無(wú)菌有齒鑷固定，手術(shù)刀反復(fù)切割組織至糊狀，放入含有3 mL 2 g/L膠原酶Ⅵ的15 mL離心管中，37 ℃孵育1 h，加入1 g/L胰蛋白酶孵育30 min。取200目濾網(wǎng)過(guò)濾后的組織置于50 mL離心管中，1 100 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS，再次離心，棄上清后加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM重懸，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀(guān)察。ADSCs及SDSCs的原代分離培養(yǎng)同上。參考文獻(xiàn)[10]的方法對(duì)3種細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.3ICs、ADSCs及SDSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ADSCs、SDSCs、ICs，當(dāng)細(xì)胞匯合率約70%時(shí)，消化并計(jì)數(shù)。2×105個(gè)細(xì)胞為一個(gè)3D混合培養(yǎng)體系，將這些細(xì)胞分裝到含有2 mL軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的15 mL離心管中，1 100 r/min離心5 min，取上清于細(xì)胞培養(yǎng)箱中直立培養(yǎng)。第3天觀(guān)察，細(xì)胞從單層細(xì)胞轉(zhuǎn)化為3D球形或橢球形，2～3 d換液1次。

1.4觀(guān)察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1、IL-6、IL-10水平的ELISA法檢測(cè) 收集3D培養(yǎng)第7、14、21天的培養(yǎng)上清，離心后取上清并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，ELISA法檢測(cè)IL-1、IL-6和IL-10濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm或570 nm。

1.4.2 成軟骨分化的形態(tài)觀(guān)察 ①細(xì)胞團(tuán)塊直徑測(cè)量：直立培養(yǎng)21 d后，將細(xì)胞團(tuán)塊移至1.5 mL EP管中，并用體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液固定。用1 mL的槍頭吸出團(tuán)塊置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，游標(biāo)卡尺測(cè)量直徑大小并留取團(tuán)塊。②阿爾新藍(lán)染色：3D培養(yǎng)21 d后收集樣本，脫水、固定并做石蠟包埋及切片。60 ℃烘箱中玻片脫蠟4 h，二甲苯脫蠟40 min，然后梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗8 min，體積分?jǐn)?shù)3%醋酸分化2 min，阿爾新藍(lán)染色40 min，核固紅溶液復(fù)染5 min，自來(lái)水沖洗。最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀(guān)察拍照，利用Image J軟件對(duì)染色面積進(jìn)行分析。③番紅O染色：直立培養(yǎng)21 d后，常規(guī)制片。60 ℃烘箱中玻片脫蠟4 h，二甲苯脫蠟40 min，梯度乙醇水化。將切片置于蘇木精工作溶液染色5～10 min，固綠(FCF)溶液染色5 min。于番紅O溶液中浸泡2 h，蒸餾水沖洗8 min。最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀(guān)察拍照，利用Image J軟件對(duì)染色面積進(jìn)行分析。

1.4.3 Ⅱ型膠原的免疫組化檢測(cè) 直立培養(yǎng)21 d后常規(guī)制片。60 ℃烘箱中玻片脫蠟1 h，二甲苯脫蠟40 min，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液微波修復(fù)15 min，蒸餾水沖洗2 min，體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min,蒸餾水沖洗，滴加山羊血清封閉液封閉1 h，Ⅱ型膠原一抗(1∶200稀釋)孵育，4 ℃過(guò)夜，二抗孵育約30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染1 min，鹽酸乙醇分化5 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀(guān)察拍照，利用Image J軟件對(duì)染色面積進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行分析，3種細(xì)胞IL-1、IL-6、IL-10分泌水平，誘導(dǎo)分化細(xì)胞團(tuán)塊直徑大小、成軟骨分化特異性染色結(jié)果的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.13種細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力見(jiàn)圖1。ICs、ADSCs及SDSCs均呈現(xiàn)出類(lèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)。其中ICs多為短梭形多分支，而另外2種細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形。

2.2誘導(dǎo)分化后3種細(xì)胞IL-1、IL-6、IL-10分泌水平的比較見(jiàn)表1。

2.33種細(xì)胞成軟骨分化結(jié)果的比較見(jiàn)圖2、表2。

A：ADSCs；B：SDSCs；C：ICs

表1 3種細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1、IL-6、IL-10的水平(n=20) ng/L

A、B、C：分別是阿爾新藍(lán)染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色

表2 3種細(xì)胞成軟骨分化結(jié)果比較(n=20)

3 討論

3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)利用磁懸浮技術(shù)為細(xì)胞提供更加接近體內(nèi)微環(huán)境的生存條件，極大地提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性[11]。有研究[12-13]表明滑膜干細(xì)胞有A、B兩種前體細(xì)胞，A細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，B細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。B細(xì)胞生長(zhǎng)快且具有成纖維特性，被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，且體外增殖速度明顯快于A細(xì)胞。SDSCs來(lái)源于B細(xì)胞，且其表面含有的CD105與成軟骨分化密切相關(guān)，同時(shí)與軟骨細(xì)胞有相似的基因表達(dá)譜。本研究在3D培養(yǎng)條件下通過(guò)成軟骨分化的Ⅱ型膠原免疫組化染色及特異性阿爾新藍(lán)、番紅O染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)SDSCs具有與軟骨細(xì)胞相同的成軟骨分化標(biāo)志物，且具有強(qiáng)的成軟骨作用。

研究[14-15]發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物全身的脂肪組織來(lái)自于胚胎發(fā)育的中胚層，主要由棕色脂肪和白色脂肪組成。ADSCs主要由白色脂肪組織組成，具有抑制IL-6、TNF、MMP3及MMP13的生物學(xué)活性[16-19]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中，ADSCs可以分泌大量的抗炎因子IL-10，而ICs分泌的促炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6較ADSCs有明顯的升高。我們可以推測(cè)ICs可能在早期骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中占主導(dǎo)作用，而ADSCs具有強(qiáng)的抗炎作用。

綜上所述，本研究模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)腔成軟骨的分化微環(huán)境，在體外條件下建立成軟骨分化體系，結(jié)果預(yù)測(cè)了SDSCs作為良好的種子細(xì)胞的可能性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)ADSCs作為抑制炎癥反應(yīng)的輔助種子細(xì)胞的可能性。接下來(lái)將聯(lián)合利用ADSCs強(qiáng)大的抑制炎癥的作用和SDSCs強(qiáng)大的再生軟骨能力共培養(yǎng)，讓兩種細(xì)胞再生軟骨再生的能力最大化。