運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

海馬組織對(duì)血糖非常敏感，糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元中可觀察到神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]及線粒體功能障礙[2]。線粒體調(diào)控凋亡通路和能量代謝[3]，在神經(jīng)細(xì)胞存亡過程中起關(guān)鍵作用，其損傷或功能障礙與糖尿病密切相關(guān)。線粒體內(nèi)膜外側(cè)的細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cyt c)不僅是呼吸鏈中的電子載體，而且是重要的凋亡起始因子[4]，在細(xì)胞凋亡信號(hào)刺激下釋放到胞漿中活化半胱氨酸基-天冬氨酸基-特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteases,caspases)，其中caspase-3是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶，負(fù)責(zé)大量底物的蛋白水解及其它許多caspases的激活。本研究擬用糖尿病大鼠模型，采用免疫印跡及RT-PCR方法觀察運(yùn)動(dòng)及中藥干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠海馬Cyt c和caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)的影響，以期為糖尿病治療提供理論基礎(chǔ)，并進(jìn)一步揭示糖尿病改善的中樞機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠50只，體重158～174 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，自由攝食飲水，自然光照。動(dòng)物房溫度為21～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素為Sigma產(chǎn)品，四葉參購自泰山四大名藥開發(fā)有限公司，血糖測(cè)試儀購自美國(guó)強(qiáng)生公司，一抗為兔抗大鼠Cyt c抗體和兔抗大鼠caspase-3抗體，購自美國(guó)CST公司，二抗為羊抗兔IgG，北京中杉金橋產(chǎn)品，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量試劑盒購自博士德公司，其它為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 糖尿病大鼠模型的制備及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，給予高脂高糖膳食4 w，然后一次性腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素，3 d后尾靜脈隨機(jī)血糖高于16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。設(shè)置糖尿病對(duì)照組(DM)、運(yùn)動(dòng)組(DMT)、中藥組(DML)、運(yùn)動(dòng)+中藥組(DMTL)。另設(shè)置正常對(duì)照組(C)。每組6只。

1.4 運(yùn)動(dòng)與中藥干預(yù)方案

采用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，速度為15 m/min，跑臺(tái)坡度為5°，每次訓(xùn)練60 min，隔日上午訓(xùn)練，持續(xù)訓(xùn)練8 w；DML及DMTL大鼠進(jìn)行中藥干預(yù)，每日灌胃四葉參多糖200 mg/kg，其余組灌服等體積的生理鹽水，持續(xù)8 w。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)海馬Cyt c和caspase-3蛋白表達(dá)

取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗膜3次，加入Cyt c和caspase-3一抗(封閉液1∶1500稀釋)4℃孵育過夜；加二抗(1∶5000)室溫?fù)u床孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，條帶灰度值反映蛋白表達(dá)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)海馬Cyt c和caspase-3 mRNA

取大鼠海馬組織，剪碎研磨，用Trizol法提取RNA，RT-PCR方法檢測(cè)Cyt c和caspase-3 mRNA。引物設(shè)計(jì)：Cyt c上游：5’-ATGCCAAGTCAAAGAATC-3’，下游5’-GAGGGCAGTAAGCATAAC- 3’；caspase-3上游：5’-GGAATGTCATCTCGCTCTG-3’，下游5’-GTCCCACTGTCT GTCTCAAT-3’；β-actin上游：5’-TGAACCCTAAGGCCAACCGTGAA-3’，下游5’-ACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物加樣于1.8%瓊脂糖凝膠，凝膠成像系統(tǒng)掃描定量電泳條帶灰度值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 血糖檢測(cè)結(jié)果

與C組相比，DM組大鼠血糖水平顯著升高(P<0.01)；與DM組相比，DMT和DMTL組大鼠血糖水平顯著降低(P<0.01)，DML組大鼠血糖水平無明顯變化(P>0.05)。見表1和圖1。

表1 各組大鼠血糖水平比較

注：與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，##P<0.01。

圖1 各組大鼠血糖水平比較

注：與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，##P<0.01。

2.2 Cytc和caspase-3蛋白檢測(cè)結(jié)果

與C組相比，DM組大鼠海馬Cyt c釋放及caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，DMT和DMTL組大鼠Cyt c釋放及caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)，DML組無顯著性變化(P>0.05)。見表2和圖2。

表2 各組大鼠Cyt c和caspase-3蛋白表達(dá)變化

注：與C組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05。

圖2 各組大鼠海馬Cyt c和caspase-3蛋白表達(dá)比較

注：與C組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05。

2.3 Cytc和caspase-3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

與C組相比，DM組大鼠海馬Cyt c和caspase-3 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，DMT和DMTL組大鼠海馬Cyt c和caspase-3 mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，DML組無顯著性變化(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬Cyt c和caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：與C組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05。

3 討 論

糖尿病是一種致病機(jī)制復(fù)雜的慢性疾病，隨著社會(huì)生活水平的不斷提高，呈現(xiàn)逐漸年輕化的趨勢(shì)。細(xì)胞凋亡在眾多致病機(jī)制中發(fā)揮了極其重要的作用[1]，而線粒體途徑是一條經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑。

由核基因編碼的Cyt c是一種水溶性蛋白，定位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)，不能通過外膜，是氧化呼吸鏈中的一個(gè)基本成分。在凋亡信號(hào)刺激下，釋放到胞漿中的Cyt c與ATP及凋亡蛋白激活因子-1相結(jié)合，活化caspases而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病大鼠海馬Cyt c釋放顯著增加，這可能是引起海馬細(xì)胞凋亡及糖尿病致病機(jī)制之一；運(yùn)動(dòng)干預(yù)及中藥輔助運(yùn)動(dòng)干預(yù)能夠降低糖尿病大鼠血糖水平，減少Cyt c基因表達(dá)及蛋白釋放，提示運(yùn)動(dòng)是改善糖尿病的一種有效方法，運(yùn)動(dòng)干預(yù)及中藥輔助運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)糖尿病的改善作用與其減少線粒體Cyt c釋放繼而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。Cyt c可能通過線粒體外膜上的凋亡誘導(dǎo)通道、外膜破裂或通過膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔而被釋放入胞漿[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠海馬線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放程度顯著增加，推測(cè)這可能是Cyt c釋放的主要通道。

Cyt c釋放是細(xì)胞凋亡的上游事件，細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者是caspases。Caspase-3被認(rèn)為是凋亡的標(biāo)志酶，通過裂解特異性底物使細(xì)胞走向凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠海馬組織caspase-3基因和蛋白表達(dá)均顯著增加，表明高血糖可導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，caspase-3激活及蛋白表達(dá)增加可能是糖尿病致病機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)及中藥輔助運(yùn)動(dòng)干預(yù)使糖尿病大鼠血糖水平下降，caspase-3的基因和蛋白表達(dá)下降，提示運(yùn)動(dòng)改善血糖的作用可能通過下調(diào)海馬caspase-3表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。單純8 w中藥干預(yù)對(duì)血糖的調(diào)節(jié)及Cyt c和caspase-3表達(dá)沒有起到顯著影響，但存在改善趨勢(shì)，需要延長(zhǎng)中藥干預(yù)時(shí)間或增加干預(yù)劑量進(jìn)一步加以研究。

綜上，運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)和四葉參聯(lián)合共同干預(yù)能夠抑制Cyt c釋放，減少caspase-3表達(dá)，這可能與糖尿病大鼠血糖水平的改善相關(guān)。