金曉艷， 黃紅雨， 趙 虎， 馬 寧， 劉 冰

(1昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院； 2昌吉州中醫(yī)醫(yī)院藥劑科， 新疆 昌吉 831100； 3新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染管理科， 烏魯木齊 830063)

鈴鐺刺[Halimodendronhalodendron(Pall.) Voss]為豆科鈴鐺刺屬種植物，主要生長在我國西北鹽堿荒漠地區(qū)，鈴鐺刺花蕾具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[1]。研究發(fā)現(xiàn)鈴鐺刺花蕾中含多糖、黃酮類、多酚類化合物等活性成分，如炮天雄多糖、金花葵籽多糖、桂七青芒果皮多糖及羅布麻多糖等，具有抗癌、提高機體免疫力、抗疲勞、延緩衰老等功效，臨床上多用于腸道疾病的的治療[2-7]。鈴鐺刺花蕾已在民間被廣泛食用，用于預(yù)防保健。本研究采用響應(yīng)面分析方法，以鈴鐺刺花蕾提取物中總多糖含量為評價指標(biāo)，優(yōu)化提取溫度、液料比和提取時間，確定鈴鐺刺花蕾多糖的最佳提取工藝，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器DH-9070A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏設(shè)備有限公司)，SY2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，GL-21M型冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，TU-1800型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 試劑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號110833-201705)，乙醇(常州恒光化學(xué)試劑有限公司，批號20170509)，苯酚(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20171020)，硫酸(常州恒光化學(xué)試劑有限公司，批號20160309)，丙酮(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20171020)。

1.3 藥材鈴鐺刺藥材2018年5月采摘于昌吉市二六工鎮(zhèn)荒灘，經(jīng)昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院中藥教研室楊衛(wèi)星高級講師鑒定為豆科鈴鐺刺屬種植物鈴鐺刺[Halimodendronhalodendron(Pall.) Voss]的花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 鈴鐺刺花蕾多糖的提取稱取50 g干燥的鈴鐺刺花蕾研磨，將鈴鐺刺花蕾粉末與蒸餾水混勻后放入恒溫水浴鍋，在不同的溫度、時間、液料比下進(jìn)行提取，過濾，將提取液減壓濃縮至原體積的1/4，加入95%乙醇，放置12 h后4 000 r/min離心20 min，向沉淀物中加入少許熱水，加入95%乙醇放置12 h后離心。沉淀物用無水乙醇、丙酮洗滌至無色，干燥后即得鈴鐺刺花蕾多糖。

2.2 鈴鐺刺花蕾多糖含量的測定配置不同濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=0.011 3X+0.092 3，R2=0.997。取“2.1”項下鈴鐺刺花蕾多糖粉末置于50 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，吸取2.5 mL溶液置于帶塞試管中，采用苯酚-硫酸法，在490 nm處進(jìn)行比色，計算多糖含量。多糖得率/%=CNV/M×103×100%，式中：C為多糖濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量(g)。

2.3 單因素實驗

2.3.1 提取溫度對鈴鐺刺花蕾多糖提取含量的影響 當(dāng)液料比為40∶1，提取時間為1 h，以不同的提取溫度(40、50、60、70、80℃)進(jìn)行單因素實驗，考察不同提取溫度對鈴鐺刺花蕾多糖提取率的影響。提取溫度在40～70℃時，鈴鐺刺花蕾多糖的得率逐漸增加，當(dāng)提取溫度為70℃時，鈴鐺刺花蕾多糖提取得率達(dá)到最大值為7.68%，因此確定提取溫度為70℃，見圖1。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響

2.3.2 液料比對多糖得率的影響 當(dāng)提取溫度為70℃，提取時間為1 h，以不同的液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)mL/g進(jìn)行單因素實驗，考察不同液料比對鈴鐺刺花蕾多糖提取率的影響。當(dāng)液料比為40∶1(mL/g)時，鈴鐺刺花蕾多糖提取得率達(dá)到最大值為7.45%，因此確定液料比為40∶1，見圖2。

圖2 液料比對多糖得率的影響

2.3.3 提取時間對多糖得率的影響 保證液料比為40∶1，提取溫度為70℃，以不同的提取時間(1、1.5、2、2.5、3 h)進(jìn)行單因素實驗，考察提取時間對鈴鐺刺花蕾多糖提取率的影響。當(dāng)提取時間為2 h時，鈴鐺刺花蕾多糖提取得率達(dá)到最大值為8.05%，因此確定提取時間為2 h,見圖3。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗設(shè)計

2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計實驗 參考單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Design Expert 10 的Box-Behnken 中心組合進(jìn)行，以提取溫度(A)70℃、液料比(B)40∶1(mL/g)、提取時間(C)2 h作為固定因子，對以上3個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析實驗，優(yōu)化鈴鐺刺花蕾多糖的最佳提取參數(shù)，見表1。

圖3 提取時間對多糖得率的影響

表1 響應(yīng)面設(shè)計實驗因素水平表

2.4.2 響應(yīng)面法設(shè)計及結(jié)果 采用Design-expert 10軟件設(shè)計鈴鐺刺花蕾多糖提取的響應(yīng)面實驗，將固定因子設(shè)置為提取溫度、液料比和提取時間，響應(yīng)值指標(biāo)設(shè)置為鈴鐺刺花蕾多糖得率，設(shè)計3個水平和3個因素的響應(yīng)面分析實驗方案，以確定鈴鐺刺花蕾多糖提取條件的最佳值，見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化的實驗方案及結(jié)果

2.4.3 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性分析 使用Design Expert10分析軟件對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，得到擬合全變量二次回歸方程：Y=8.55+0.38A+0.36B+0.48C-0.11AB-0.07AC+0.13BC-0.63A2-0.80B2-1.16C2(R2=0.971 5)。本模型的F值為26.54，P值為0.000 1，已經(jīng)達(dá)到高度顯著的等級，說明本模型具有顯著性；失擬項的P值為0.931 6，不顯著，說明所建立模型擬合程度較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.971 5，AdjR2=0.934 9，證明模型的實際值與預(yù)測值之間相關(guān)性較好。結(jié)果表明A、B、C 3個因素對鈴鐺刺花蕾多糖得率的影響顯著，3個因素之間的交互作用AB、AC、BC對最終結(jié)果影響不顯著，二次項A2、B2、C2對最終結(jié)果影響顯著。以上結(jié)果表明A、B、C是鈴鐺刺花蕾多糖提取過程中的重要影響因素，各因素之間不存在較大影響；根據(jù)數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果，3個因素對鈴鐺刺花蕾多糖得率的影響大小排序為：C>B>A，見表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析

注：*為顯著，P<0.05。

2.4.4 根據(jù)響應(yīng)面三維圖和等高線圖分析因素間的相互作用 響應(yīng)面優(yōu)化法是多種參數(shù)因素的工藝優(yōu)化的使用頻率較高的方法。通過對響應(yīng)面圖和等高線圖的分析能夠看出，在最優(yōu)條件下不同的變量的取值和所產(chǎn)生交互作用。本研究分析了提取溫度(A)、液料比(B)、提取時間(C)這3個工藝參數(shù)之間的相互作用對鈴鐺刺花蕾多糖得率所產(chǎn)生的影響。提取溫度與液料比之間并不存在較強的交互作用，響應(yīng)面的峰值位于提取溫度的0～1水平和液料比的0～1水平；提取溫度與時間之間也并不存在較強的交互作用，響應(yīng)面的峰值位于提取溫度的0～1水平和提取時間的0～1水平；液料比與提取時間之間也并不存在較強的交互作用，響應(yīng)面的峰值位于液料比的0～1水平和提取時間的0～1水平，見圖4-6。

圖4 相互作用AB對多糖得率影響的分析圖

圖5 相互作用AC對多糖得率影響的分析圖

圖6 相互作用BC對多糖得率影響的分析圖

2.5 驗證實驗驗證實驗表明鈴鐺刺花蕾中多糖最佳提取工藝為：提取溫度72.7℃，液料比42.2∶1(mL/g)，提取時間2.1 h，預(yù)測鈴鐺刺花蕾多糖得率可達(dá)8.70%。在實際操作中將條件調(diào)整為：提取溫度73℃，液料比42∶1(mL/g)，提取時間2.1 h，按此參數(shù)進(jìn)行實驗確認(rèn)，最終鈴鐺刺花蕾多糖得率為8.64%，與預(yù)測值接近，說明模型能夠很好地預(yù)測鈴鐺刺花蕾多糖的實際得率。

3 討論

鈴鐺花蕾多糖的提取得率受提取溫度、液料比、提取時間的影響。適宜的提取溫度能夠增加多糖分子的熱運動，增加擴散的系數(shù)有助于鈴鐺刺花蕾多糖的浸出[8-9]；不同的液料比能夠增加多糖和蒸餾水之間的濃度梯度[10-11]；最適的提取時間能夠提升多糖的滲透和溶解速率[12-15]。本研究通過優(yōu)化提取溫度、液料比、提取時間3個影響因素，提升鈴鐺花蕾多糖的提取得率，經(jīng)優(yōu)化后的提取工藝成本降低、耗能減少、穩(wěn)定性增強，適用于鈴鐺花蕾中多糖的提取。