趙冬冬，王瑞芳，何靜波，楊玉梅,杜建喜

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院)

廣棗Choerospondias axillaris(Roxb.) Burttet Hill.，又名南酸棗，也叫山棗子，五眼果，鼻涕果，屬漆科(Anacardiaceac)，高大落葉喬木[1]。目前，不論是國家藥典、還是內(nèi)蒙古成藥標(biāo)準(zhǔn)收載的廣棗及廣棗制劑，都是指廣棗的干燥成熟果實，即廣棗[2,3]，其主要活性成分為黃酮類，即廣棗總黃酮(Total Flavones of Choerospondias Axillaris Fructus)[4-9]。目前，廣棗葉被當(dāng)作廢物丟棄，有關(guān)廣棗葉化學(xué)成分的研究鮮有報道。本文擬從廣棗葉中提取總黃酮并與廣棗果實進(jìn)行初步對比。

1 實驗材料

1.1藥材及試劑 廣棗果實，購自廣西玉林中藥材市場，部分采自于湖南瀏陽官橋鎮(zhèn)山區(qū)與廣西容縣大榮山區(qū)，由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院林果專業(yè)博士副教授李林峰鑒定為漆木科植物南酸棗的干燥成熟果實；廣棗葉，采自湖南瀏陽官橋鎮(zhèn)山區(qū)，經(jīng)廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院林果專業(yè)博士副教授李林峰鑒定為漆木科植物南酸棗的新鮮葉。蘆丁對照品，北京恒遠(yuǎn)啟天化工技術(shù)研究院和北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制。乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鋁等試劑均為分析純。

1.2儀器 RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-1780紫外分光光度計(日本島津)；FA1204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；HH-4數(shù)縣恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1實驗材料的前處理 將購來的或采集來的廣棗及廣棗葉，可見光下檢查是否霉壞、腐爛或者蟲蛀，剔除殘品后分別搗碎，保存好，備用。

2.2總黃酮的提取 上述處理過的廣棗和廣棗葉各稱取140 g，分別裝在2 000 mL的三腳圓底燒瓶，用8倍量的70 %(v/v)的乙醇進(jìn)行水浴加熱回流提取1.5 h，各平行提取3次，收集各次提取的溶液，過濾除掉藥渣，然后在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成膏[5,10]。烘箱適溫干燥成固體膏狀物稱量得到果實和葉子的粗出膏分別為14.20 g，40.40 g，粗出膏率分別為10.14 %，28.86 %。

2.3石油醚萃取脫脂 將上述干燥得到的廣棗和廣棗葉提取物用50 %(v/v)乙醇溶解，然后加入石油醚進(jìn)行攪拌萃取，萃取多次直至各次提取物醚層無顏色。收集石油醚下層溶液，濃縮干燥[11]，稱量，得到廣棗和廣棗葉萃取脂性成分后干膏各為12.70g，33.39 g，計算得到兩者出膏率各為9.07 %，23.85 %。

2.4黃酮類的檢識 各取上述經(jīng)萃取脂性成分后廣棗和廣棗葉樣品甲醇溶液于試管中，分別加入顯色試劑，觀察各反應(yīng)的變化現(xiàn)象，顯色反應(yīng)為陽性[12]，見表1。

表1 黃酮類的顯色反應(yīng)

2.5定量測試—標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定總黃酮含量

2.5.1黃酮最佳吸收波長的選擇 在標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定總黃酮含量前，須要確定黃酮定量測定最佳波長。其方法：取上述萃取后的廣棗溶液1mL,按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作，實驗測得樣品在506 nm處有最大吸收值，與文獻(xiàn)所述蘆丁對照品的最佳測定波長510 nm相近，見圖1。本實驗對廣棗和廣棗葉提取總黃酮的測定參考一般黃酮量化分析方法以蘆丁為對照品，測定總黃酮含量。

圖1 黃酮最佳吸收波長的選擇

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取干燥恒重蘆丁對照品10.0 mg，用70 %(v/v)乙醇稀釋充分溶解后定容至100 mL容量瓶里。分別量取上述配好的溶液0.0 mL，2.5 mL，5.0 mL，7.5 mL，10.0 mL，12.5 mL于25 mL容量瓶，用移液管吸取70 %(v/v)的乙醇溶液使體積至12.5mL。然后向各容量瓶分別依次加入新配好的1.0mL 5 %μg/mL) NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；然后加入1.0 mL 10 % (μg/mL)Al(NO3)3溶液，搖勻,靜置6 min 后；加入10.0 mL 4 %μg/mL) NaOH溶液，用70 %(v/v)的乙醇溶液定容至25 mL后搖勻,靜置20 min。以試劑作空白，于510 nm處進(jìn)行定量測定。獲得回歸方程:A=12.125714×C+ 0.006524r=0.999795，見表2；得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

表2 蘆丁對照品濃度與吸光度

2.5.3廣棗和廣棗葉提取物含量的測定 精密稱取廣棗固體膏狀樣品26.6 mg，廣棗葉固體膏狀樣品11.2 mg分別裝于100 mL容量瓶，充分溶解定容，隨后各取上述配好的樣品溶液2.5 mL裝于25 mL容量瓶按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法操作，測得廣棗的吸光度A=0.027，廣棗葉的吸光度A＇=0.041，代入回歸方程，計算廣棗與廣棗葉的總黃酮含量，見表3。

注：廣棗總黃酮含量=C×稀釋倍數(shù)/取樣量×出膏率。同樣運用該公式計算得到廣棗葉總黃酮含量。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1精密度試驗 準(zhǔn)確量取對照品蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備中方法，顯色后在510 nm波長下重復(fù)測定5次吸光度結(jié)果RSD= 0.69 %。表明本實驗所用儀器精密度良好，滿足實驗含量測定的要求，結(jié)果見表4。

2.6.2穩(wěn)定性試驗 取本實驗供試品廣棗總黃酮提取液10mL，按照繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色后，分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min測定其吸光度，RSD=0.95 % , 數(shù)據(jù)表明，供試品在30 min內(nèi)其穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表5。

2.6.3重復(fù)性試驗 取本實驗供試品廣棗葉總黃酮提取液10mL，進(jìn)行5次平行吸光度測定實驗，RSD=1.06 %，結(jié)果表明該實驗方法的重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表6。

2.6.4加樣回收率試驗 取本實驗供試品廣棗葉總黃酮提取液1 mL，置于10 mL的容量瓶中，分別加入0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL，搖勻，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法顯色，測其吸光度，計算回收率?；厥章?(實驗測值—樣品中的總黃酮含量/蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品加入含量×100 %)，測得平均回收率為98.11 %，RSD=0.83 %(n=6)結(jié)果見表7。

表7 加樣回收率試驗結(jié)果

3 討論

本實驗采用回流提取法分別提取廣棗葉和廣棗果實中的總黃酮類，以蘆丁為對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定廣棗葉和廣棗果實中總黃酮含量。實驗結(jié)果顯示，廣棗和廣棗葉提取物黃酮類檢識反應(yīng)均呈陽性，廣棗葉中總黃酮含量1.745 mg/mL,廣棗果實中總黃酮含量0.580 mg/mL。結(jié)果表明，廣棗葉中也存在總黃酮，且含量高于廣棗果實中的總黃酮含量。

廣棗總黃酮制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用甚廣，研制出來的方劑越來越多，應(yīng)用廣泛。隨著該植物藥用價值進(jìn)一步發(fā)掘，勢必對廣棗藥材原料需求產(chǎn)生新的挑戰(zhàn)。因此尋找該藥材的替代物和拓展該藥材植物新的藥用部位就顯得非常重要和必要。本研究結(jié)果提示，廣棗葉有可能成為傳統(tǒng)廣棗的替代品。