顧 鵬，陳傍柱，徐 濤，劉 聞，鄧俊成，徐名襯， 袁 進(jìn)，陳恩生，顧為望，4*

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510515；2. 東莞松山湖明珠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司， 廣東 東莞 523808；3. 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州 510315；4.五邑大學(xué)，廣東 江門 529020)

4-羥基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase，4HPPD/HPD)作為一種參與大多數(shù)生物體內(nèi)酪氨酸分解代謝第二步所需的酶，存在于哺乳動(dòng)物的肝和腎中，能夠?qū)?-羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸(圖1)[1-2]。在III型酪氨酸血癥(Mckusick 27671)中，該酶活性低甚至不存在，臨床上主要表現(xiàn)為血清酪氨酸水平和尿液4-羥基苯丙酮酸、4-羥基苯乳酸、4-羥基苯乙酸水平顯著升高?；颊咄ǔ?huì)出現(xiàn)神經(jīng)異常、智力遲鈍和輕度共濟(jì)失調(diào)，但尚未確定一致的表型[3]。越來越多的人開始關(guān)注這種疾病以及HPD阻滯的后果。本研究擬通過敲除Hpd基因建立高酪氨酸血癥III型巴馬小型豬模型，為更好地研究該疾病的本質(zhì)和治療方法提供可靠的大動(dòng)物模型。

圖1 酪氨酸代謝通路及其相關(guān)疾病Figure 1 Tyrosine catabolic pathway and related diseases

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6頭巴馬小型豬，普通級(jí)飼養(yǎng)，其中2頭作為代孕母豬(24月齡)，體重40 kg；4頭作為供卵母豬(12月齡)，體重30～35 kg，均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)[SCXK (粵) 2016-0041]，采卵和胚胎移植手術(shù)在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大動(dòng)物手術(shù)室進(jìn)行[SYXK (粵) 2016-0167]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，所有手術(shù)操作均在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會(huì)審核通過(L2016088)。

1.1.2 載體

sgRNA載體pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin和Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9均購自Addgene。載體經(jīng)轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序分析，均正確后用作體外轉(zhuǎn)錄模板。

1.2 主要試劑與儀器

sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑MEGAshortscriptTMKit(AM1354)和Cas9體外轉(zhuǎn)錄試劑mMESSAGE mMACHINE?T7 Ultra Kit (AM1345)均購自Ambion；酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1(PH>7.8)(P1012)抽提試劑購自北京索萊寶科技有限公司；X5高保真DNA聚合酶 (MF003)購自聚合美生物科技有限公司； 2× Taq PCR Master Mix (DBI-2028)購自DBI Bioscience；基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit(DP304-03)購自TIANGEN BIOTECH(BEIJING)；TA克隆試劑pMD19-T Vector Cloning Kit (T6013)購自大連Takara公司；四烯雌酮購自北京科益豐生物技術(shù)發(fā)展有限公司。顯微操作系統(tǒng)TransferMan NK2購自Eppendorf公司；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)購自O(shè)lympus公司；體視顯微鏡購自Nikon公司，拉針儀、磨針儀、鍛針儀毛細(xì)玻璃管均購自日本Narishige公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿購自Corning公司；胚胎培養(yǎng)箱購自Thermo公司；胚胎移植管購自北京比威克生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SgRNA-Hpd和Cas9 mRNA獲取

通過GeneBank網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找豬Hpd基因組序列。利用CRISPR設(shè)計(jì)網(wǎng)頁(http://crispor.tefor.net)于豬Hpd基因第6號(hào)外顯子上(E6)設(shè)計(jì)20 bp的靶向序列，并合成兩條互補(bǔ)的單鏈oligos。退火形成雙鏈后連接到pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin載體的Bsa I位點(diǎn)。以上述產(chǎn)物為模板通過X5高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成sgRNA體外轉(zhuǎn)錄所需的模板制備。sgRNA-Hpd正向引物：5’-TTAAT ACGACTCACTATAGAGTGAAGGACATTGCGTTCG-3’；sgRNA-Hpd反向引物；5’-AAAAGCACCGAC TCGGTGCC-3’。sgRNA模板獲取PCR反應(yīng)條件：98℃，5 min，98℃，30 s 60℃，30 s 72℃，30 s，37個(gè)循環(huán)，72℃，10 min，4℃保存。應(yīng)用MEGAshortscriptTMKit試劑盒對(duì)上述體外轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA-Hpd。用限制性內(nèi)切酶AgeI 對(duì)Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9酶切線性化，用于Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄模板，應(yīng)用Cas9體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE?T7 Ultra Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲取Cas9 mRNA[4-5]。所有產(chǎn)物經(jīng)酚氯仿抽提純化乙醇沉淀后回收并溶于無核酸酶的水中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 巴馬小型豬同步發(fā)情與受精卵獲取

供卵母豬和代孕母豬均拌料飼喂給藥四烯雌酮20 mg/d，連續(xù)飼喂18 d誘導(dǎo)同步發(fā)情。停藥后，每天上午和下午，均在豬采食30 min后，通過壓背法和外陰觀察法檢測(cè)母豬的發(fā)情狀態(tài)，當(dāng)母豬出現(xiàn)“靜立反射發(fā)情”時(shí)即可進(jìn)行自然交配。12～14 h后通過手術(shù)沖卵方法收集巴馬小型豬豬受精卵。

1.3.3 Cas9 mRNA和sgRNA的受精卵胞質(zhì)內(nèi)共注射

用RNase-free water(胚胎水)將Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd分別稀釋至100 ng/μL和50 ng/μL。隨后將混合物注射入巴馬小型豬單細(xì)胞期受精卵的胞質(zhì)中，注射完成后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)30～60 min，挑選狀態(tài)良好的受精卵行胚胎移植。

1.3.4 胚胎移植及妊娠檢測(cè)

將選好的發(fā)情代孕母豬通過戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，手術(shù)切開下腹部一小口，找出一側(cè)子宮角和輸卵管傘部，將受精卵用胚胎移植管移植至一側(cè)的輸卵管中，每頭代孕母豬移植10枚受精卵。移植后19～21 d，用豬早孕檢測(cè)試紙檢測(cè)是否妊娠。

1.3.5 基因型鑒定

每頭F0代巴馬小型豬分別進(jìn)行耳號(hào)標(biāo)記并剪取少量耳組織，用基因組提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit提取基因組DNA。設(shè)計(jì)相應(yīng)PCR引物擴(kuò)增巴馬小型豬HPD基因6號(hào)外顯子(表1)，用TAQ酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。并將PCR產(chǎn)物用pMD19-T Vector Cloning Kit進(jìn)行TA克隆。最后挑取10個(gè)單克隆，測(cè)序分析。

1.3.6 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

按照標(biāo)準(zhǔn)操作提取#3和#4巴馬小型豬肝組織全蛋白并進(jìn)行濃度測(cè)定，取20 μg進(jìn)行蛋白電泳。SDS-PAGE分離膠和濃縮膠分別按照濃度為10%和5%配置，電壓為恒壓80 V，30 min；120 V，60 min。電泳結(jié)束后切下目的蛋白與內(nèi)參條帶，轉(zhuǎn)膜：恒定電流200 mA, 120 min。5% BSA溶液封閉1 h。一抗4℃孵育過夜(Anti-HPD antibody，ab232906)，TBST洗膜10 min×3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W(xué)發(fā)光儀顯影。

1.3.7 血液氨基酸檢測(cè)

(1)樣品采集：仔豬出生15 d后，將新鮮外周血采集后滴于專用采血濾紙上，自然晾干3 h，待完全干燥后放于封口塑料袋內(nèi)，置于-20℃冰箱中保存待檢。

(2)樣品處理方法：本研究用血液氨基酸檢測(cè)儀器為美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)3200QTRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀。將干燥血液濾紙片用打孔器制成直徑為3 mm的圓形濾紙血片后置于96孔聚丙烯板中(高低各1各質(zhì)控)。同時(shí)，向每孔加入甲醇溶液100 μL(含有同位素內(nèi)標(biāo))，用Teflon膜覆蓋，置于45℃環(huán)境密封震蕩45 min，設(shè)置振蕩頻率為650 r/min。震蕩完畢后室溫放置20 min，轉(zhuǎn)移其中75 μL至新的96孔聚丙烯板并用鋁膜覆蓋，隨后即可上樣檢測(cè)[6]。

表1 巴馬小型豬HPD基因6號(hào)外顯子擴(kuò)增引物

(3)數(shù)據(jù)分析：定量分析采用美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司軟件ChemoView1.2(Applied Biosystems)，根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)及其相對(duì)應(yīng)的離子峰強(qiáng)度，根據(jù)濃度已知的內(nèi)標(biāo)，即可自動(dòng)計(jì)算出樣品中所含氨基酸的濃度。

1.3.8 尿液酪氨酸代謝產(chǎn)物檢測(cè)

(1)尿樣采集和預(yù)處理：通過仔豬代謝籠收集豬尿樣10 mL于15 mL離心管中，迅速置于-20℃冰箱保存待檢測(cè)。尿液樣本經(jīng)3500 r/min離心10 min以去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，并取上清測(cè)定尿肌酐值。

(2)樣品處理方法：將預(yù)處理樣品根據(jù)所測(cè)定肌酐值取0.2 mg肌酐量的尿液加入1 U/μL尿素酶共20 μL，置于37℃反應(yīng)30 min后取出加入內(nèi)標(biāo)液和純水補(bǔ)足終體積為2 mL。然后依次加入5%鹽酸羥胺500 μL和2.5 mol/L 氫氧化鈉溶液400 μL混勻后于室溫靜置1 h。待反應(yīng)完成后加入6 mol/L鹽酸350 μL終止反應(yīng)并加入乙酸乙酯6 mL混勻，3500 r/min離心5 min取有機(jī)相至另一試管中并重復(fù)一次。加入無水硫酸鈉離心吸取上清液，于60℃恒溫用氮?dú)獯蹈蓸颖?。向樣品中加入BSTFA+10%TMCS硅烷化試劑100 μL，置于80℃恒溫箱中30 min，衍生完成后待樣品冷卻即可取樣檢測(cè)。

(3)色譜及質(zhì)譜條件：本研究所用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為日本島津GCMS-QP2010 ultra分析儀。色譜柱DB25(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280℃；柱溫100℃持續(xù)4 min，以4℃/min的速率升溫至280℃，保持10 min，再以10℃/min升溫至300℃保持10 min；載氣：高純氦氣(99.999%)；氣體流速：43.0 cm/s，分流比20∶1；接口溫度280℃；離子源溫度：200℃；質(zhì)譜掃面范圍：50～500 amu。數(shù)據(jù)分析軟件為GCMS Solution 4.11。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA設(shè)計(jì)及Cas9 mRNA和sgRNA制備

sgRNA-Hpd設(shè)計(jì)位點(diǎn)如圖2所示。體外轉(zhuǎn)錄后經(jīng)RNA電泳顯示其中sgRNA-Hpd片段大小為120 bp左右，Cas9 mRNA片段大小為4300 bp左右。表明成功制備了Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd。

2.2 受精卵胞質(zhì)內(nèi)共注射Cas9 mRNA和sgRNA建立HPD基因修飾巴馬小型豬

將20枚巴馬小型豬的單細(xì)胞期受精卵予以胞質(zhì)內(nèi)顯微共注射Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd(圖3)。移植至2只代孕母豬。2只代孕母豬懷孕，共出生2窩，獲得F0代巴馬小型豬共4只，公母比例為2∶2(表2)。

2.3 基因型鑒定

TA克隆的測(cè)序結(jié)果如表3所示。測(cè)序結(jié)果顯示4頭F0代中1只為野生型，Hpd基因未發(fā)現(xiàn)有突變，與野生型巴馬小型豬的Hpd基因序列完全一致。其余3頭F0代巴馬小型豬在sgRNA-Hpd所介導(dǎo)定位的Hpd基因位點(diǎn)上出現(xiàn)了隨機(jī)刪除或插入若干個(gè)堿基(表3)。結(jié)果表明，F(xiàn)0代巴馬小型豬Hpd基因突變位點(diǎn)具有長(zhǎng)度可變或堿基對(duì)替換數(shù)目可變的特點(diǎn)。這些DNA序列的變化通常導(dǎo)致編碼區(qū)域的截?cái)嗷蚓幋a框架移位，從而導(dǎo)致Hpd基因功能障礙。

圖2 sgRNA-Hpd設(shè)計(jì)位點(diǎn)Figure 2 The design sites of sgRNA-Hpd

表2 F0代巴馬小型豬出生情況對(duì)比

表3 F0代仔豬Hpd基因突變

注：WT：野生型；“△”：堿基刪除；“+”：堿基插入。

Note. WT: wild type; “△”: base deletion; “+”: base insertion.

圖3 豬受精卵胞質(zhì)內(nèi)共注射Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd與F0代巴馬小型豬Figure 3 F0 generation of newborn Bama minipig pups with HPD gene mutations generated by CRISPR/Cas9 system zygote injection

圖5 血液酪氨酸代謝水平Figure 5 Metabolic profile of the tyrosinemia type III Bama minipigs

2.4 HPD蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，未發(fā)生Hpd基因敲除的巴馬小型豬(#4)與野生型巴馬小型豬相比，肝組織HPD蛋白表達(dá)量未發(fā)生任何改變；相反，#3巴馬小型豬由于Hpd基因敲除后，肝組織HPD蛋白則完全沒有表達(dá)。

圖4 HPD蛋白表達(dá)水平Figure 4 The relative expression of HPD protein

2.5 血液酪氨酸水平

血液酪氨酸檢測(cè)結(jié)果顯示，和野生巴馬小型豬血液酪氨酸水平相比，#1、#2、#3巴馬小型豬發(fā)生Hpd基因敲除后血液酪氨酸水平明顯上升，均達(dá)到1200 μmol/L以上；相反，由于酪氨酸水平上升，苯丙氨酸處于正常水平，苯丙氨酸和酪氨酸比值(Phe/Tyr)在發(fā)生Hpd基因敲除巴馬小型豬(#1、#2、#3)中顯著降低。見圖5。

2.6 尿液氨基酸代謝產(chǎn)物含量

顯著升高的尿液4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平是高酪氨酸血癥III型的重要臨床特征。通過基因型鑒定我們已確認(rèn)#1和#2巴馬小型豬模型成功敲除Hpd基因，通過氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測(cè)尿液酪氨酸代謝產(chǎn)物水平結(jié)果顯示，與野生型巴馬小型豬相比，#1和 #2巴馬小型豬尿液4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平明顯上升。見圖6。

圖6 尿液酪氨酸代謝產(chǎn)物Figure 6 Urinary excretion of tyrosine metabolites

3 討論

血液酪氨酸水平的升高和尿液4-羥苯丙酮酸及其衍生物的增加常被認(rèn)為是遺傳性酪氨酸血癥的顯著特征。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯巴馬小型豬Hpd基因成功制備了高酪氨酸血癥III型巴馬小型豬模型。通過基因型鑒定確認(rèn)了其中3只巴馬小型豬的Hpd基因發(fā)生敲除，1只未發(fā)生敲除，整體敲除效率達(dá)到75%。為檢測(cè)是否存在脫靶效應(yīng)，我們將外顯子序列中與sgRNA-Hpd匹配達(dá)到15 bp以上基因序列作為潛在可能的脫靶位點(diǎn)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后送樣進(jìn)行Sanger測(cè)序，所有檢測(cè)的潛在脫靶位點(diǎn)均未發(fā)生突變，所以我們猜想，#4巴馬小型豬未發(fā)生突變可能的原因是因?yàn)轱@微注射未成功或是sgRNA-Hpd未成功打靶。為進(jìn)一步確認(rèn)其表型，我們通過Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除Hpd基因后巴馬小型豬肝組織HPD蛋白完全不表達(dá)，通過檢測(cè)巴馬小型豬的血液氨基酸濃度，發(fā)現(xiàn)Hpd基因敲除的3只巴馬小型豬酪氨酸濃度顯著升高；進(jìn)一步我們通過氣相色譜檢測(cè)尿液酪氨酸代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)Hpd基因敲除巴馬小型豬的尿液4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平顯著上升，這與人類III型酪氨酸血癥的臨床特征一致(Endo等人1983)[7]。而僅僅是HPD酶活性缺乏似乎不會(huì)引起肝腎功能異常[8]。

可以預(yù)料，隨著串聯(lián)質(zhì)譜法的使用越來越多，以及在新生兒篩查項(xiàng)目中納入酪氨酸測(cè)量，持續(xù)高酪氨酸水平的無癥狀嬰兒數(shù)量將越來越多。根據(jù)本文提供的數(shù)據(jù)，巴馬小型豬高酪氨酸血癥III型模型可作為人類III型酪氨酸血癥的理想的模型。這一新的基因敲除巴馬小型豬遺傳性酪氨酸血癥可以用來深入了解4-羥基苯丙酮酸氧化酶在遺傳性酪氨酸血癥中的作用，為更好地研究和治療酪氨酸代謝相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。