商 業(yè)， 白忠臣， 黎顯繼， 張正平

(1.貴州大學(xué) 大數(shù)據(jù)與信息工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué) 貴州省光電子技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引 言

光譜分析是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)和工業(yè)發(fā)展中的一個(gè)重要研究方向，與傳統(tǒng)的色譜分析[1]、質(zhì)譜分析[2]和電化學(xué)分析[3]等相比，其具有操作方便、消耗試劑量小、重復(fù)性好、測(cè)量精度高和檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，非常適合對(duì)低濃度的檢測(cè)物進(jìn)行快速檢測(cè)。光譜分析可分為發(fā)射光譜分析和吸收光譜分析兩種。吸收光譜法在高精度檢測(cè)中是一種快捷、簡(jiǎn)單并且成本較低的檢測(cè)方法，適用于蛋白質(zhì)[4]、氨基酸[5]等生物分子和半導(dǎo)體材料[6]的檢測(cè)。如何提高吸收光譜靈敏度是近年來研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)研究出的幾種提高吸收光譜靈敏度的技術(shù)有光聲光譜技術(shù)[7]、腔增強(qiáng)光譜技術(shù)[8]、積分球技術(shù)[9]和衰減全反射紅外光譜技術(shù)[10]，但這些技術(shù)都需要相當(dāng)復(fù)雜且昂貴的設(shè)備，以及專業(yè)的操作人員。因此，發(fā)展新型的低成本、高靈敏度的光譜技術(shù)是當(dāng)前科學(xué)研究中的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)的吸收光譜法受吸收光程等因素的限制，難于進(jìn)一步提高靈敏度和檢測(cè)限，限制了其在微小量樣品檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。因此，提高吸收光程是吸收光譜技術(shù)的核心問題。多階散射增強(qiáng)吸收光譜法是一種簡(jiǎn)單、可調(diào)節(jié)的光學(xué)檢測(cè)方法，適合測(cè)量濃度較低的被檢測(cè)物[11～13]。與傳統(tǒng)的吸收光譜技術(shù)相比，多階散射光譜法能夠提高光在被測(cè)樣品中的光程，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度、降低檢測(cè)噪聲，為微量樣品檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)方法。多階散射技術(shù)通過懸浮在含有需要檢測(cè)的樣品溶液中的微球使入射光經(jīng)過被檢測(cè)樣品時(shí)發(fā)生多次散射，來延長(zhǎng)光穿過被檢測(cè)樣品的光路長(zhǎng)度。但該技術(shù)仍有著傳統(tǒng)吸收光譜法的優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)單、快捷且成本低。

本文通過在Cy3熒光染料水溶液中加入水相單分散的二氧化硅(SiO2)納米微球，使其充當(dāng)隨機(jī)散射介質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)光的多次散射，增加檢測(cè)光程長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)光譜吸收的增強(qiáng)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

粒徑為200，400 nm的SiO2納米微球單分散液和表面含羧基的Cy3熒光探針試劑分別購(gòu)自北京北達(dá)巨邦生物技術(shù)有限公司和南京拜恩特斯生物科技有限公司。分別取2，4，6，8，10，12 μL的不同粒徑的SiO2納米微球單分散液(0.05 mg/mL)裝入容量為4 mL的離心管中，再在每個(gè)離心管中加入20 μL的Cy3溶液(0.25 mg/mL)，加入去離子水定容至3 mL，配成水溶液。超聲分散2 min，使SiO2納米微球在含有Cy3熒光試劑的水溶液中均勻分散。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室自行搭建的測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行吸收光譜測(cè)量，激發(fā)光源 (鹵素?zé)艄庠?經(jīng)過貼有三面平面鏡(鏡面朝內(nèi))的盛有待檢測(cè)溶液的石英比色皿中，由鏡面反射所收集到的光透過樣品，再經(jīng)過兩面聚光透鏡由光纖耦合器傳給海洋光學(xué)的QE65000科研型光譜儀，最后由計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與處理。測(cè)量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。吸收光譜測(cè)量范圍為350～750 nm。以上所有測(cè)量均在室溫下進(jìn)行。

所有被測(cè)樣品的吸收光譜都經(jīng)過反復(fù)測(cè)量。為了消除光源和測(cè)量系統(tǒng)對(duì)被測(cè)樣品吸收光譜的影響，對(duì)所有被測(cè)樣品的吸收光譜均進(jìn)行了歸一化處理。

圖1 吸收光譜測(cè)量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意

2 數(shù)據(jù)處理

采用差值法[14]來消除由于納米SiO2微球自身帶來的吸收貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)將含有相同濃度納米SiO2微球的水溶液和Cy3熒光染料水溶液分為一組，對(duì)每組取差值，可得到Cy3熒光染料水溶液的吸收光譜信號(hào)

aCy3(λ)=aCb(λ)-ab(λ)

(1)

式中aCb(λ)為Cy3熒光染料水溶液與單分散SiO2微球混合水溶液的吸收光譜信號(hào)，ab(λ)為單分散SiO2微球水溶液的吸收光譜信號(hào)。aCy3(λ)排除了SiO2微球本身材料的干擾，是只取決于Cy3熒光染料原料本身的吸收特性的吸收光譜信號(hào)。

通過計(jì)算每組被檢測(cè)溶液的差值譜就可以排除散射介質(zhì)自身所帶來的干擾，得到Cy3水溶液在不同濃度的SiO2微球作用下的吸收光譜。

3 結(jié)果與討論

當(dāng)光線通過含有均勻的被測(cè)樣品的比色皿時(shí)，其光路是由盛樣品的比色皿決定。如果樣品分布不均勻，則通過的光經(jīng)歷多次散射后在空間分布中表現(xiàn)出明顯的折射率變化。如圖2所示，在未加入SiO2微球前，Cy3溶液的檢測(cè)光路為l;而在向Cy3的溶液中加入SiO2微球后，由于SiO2微球?qū)膺M(jìn)行了多次散射，使得檢測(cè)光路比原本的光路l更長(zhǎng)，這樣就形成了多階散射增加光程的現(xiàn)象，從而提高了檢測(cè)的靈敏度。

根據(jù)朗伯—比爾定律[15]即式(2)來測(cè)量Cy3溶液的吸光度，A=-ln(I/I0)=αCl，其中，I0為入射光強(qiáng)，I為透射光強(qiáng)。當(dāng)光被透明溶劑中溶解的物質(zhì)所吸收時(shí)，吸收系數(shù)α、溶液的濃度C和光程l與吸光度A成正比。因此，采用增加光程l來提高吸光度A。

圖2 檢測(cè)光程及SiO2微球散射示意

本文中光程l的增加與入射光在被檢測(cè)溶液中通過無序介質(zhì)SiO2微球的次數(shù)有關(guān)[11]。光程與入射光通過SiO2微球的平均自由路徑(lfree)的倒數(shù)成正比

l～1/lfree

(2)

平均自由路徑lfree由介質(zhì)SiO2微球的濃度C、粒徑d和散射截面σsca決定的

(3)

式中F=πd3C/6，Qsca為單個(gè)SiO2微球的散射效率，g為平均散射角。

一般情況下，當(dāng)微球尺寸遠(yuǎn)小于入射光波長(zhǎng)時(shí)，可采用瑞利散射描述散射光強(qiáng)與光波波長(zhǎng)之間的關(guān)系;當(dāng)微球尺寸與入射光波長(zhǎng)相當(dāng)時(shí)，則利用米氏散射進(jìn)行描述[16,17]。本文使用的SiO2微球粒徑為200，400 nm，與可見—紫外光波長(zhǎng)相近。因此根據(jù)米氏散射理論來處理SiO2微球與光的相互作用時(shí)的散射特性[18]，對(duì)不同半徑的SiO2微球在水中的散射效率進(jìn)行分析，可以得到不同半徑的SiO2納米微球在水溶液中的散射效率Qsca，即Qsca=σsca/πa2，其中σsca為散射截面，a為SiO2納米微球的半徑。如圖3所示，在可見光的大部分范圍下SiO2微球有相對(duì)較高的散射效率(Qsca≈3.5)，在同一波長(zhǎng)下，隨著SiO2微球半徑的增加，散射效率Qsca也在逐漸增加。

圖3 不同半徑的SiO2微球的米氏散射效率

圖4是由實(shí)驗(yàn)室自行搭建的測(cè)量系統(tǒng)所測(cè)得的Cy3水溶液與純水歸一化后的吸收光譜，Cy3水溶液在517 nm和547 nm處各有兩個(gè)吸收峰，且547 nm處的吸收較高，這與文獻(xiàn)中關(guān)于Cy3在紫外可見光波段的吸收光譜的相一致[19]。在這里，基線是由裝有相同體積純水的比色皿測(cè)量所確定，可以看出，水沒有對(duì)Cy3水溶液的吸收帶來影響。

圖4 Cy3水溶液與純水歸一化吸收光

由實(shí)驗(yàn)室自行搭建的測(cè)量系統(tǒng)測(cè)得的粒徑為200，400 nm不同濃度SiO2微球與相同濃度的Cy3水溶液混合的吸收光譜經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后的結(jié)果如圖5所示。

圖5 二種粒徑下的不同濃度SiO2微球與Cy3混合的吸收光譜

當(dāng)粒徑一定時(shí)，隨著SiO2微球含量的增加，Cy3溶液的吸收強(qiáng)度都在逐步增強(qiáng)。這是由于SiO2微球起到了散射作用，SiO2微球濃度的增加，散射作用增強(qiáng)，檢測(cè)的光程l也逐漸增長(zhǎng)，導(dǎo)致Cy3水溶液的吸收也增強(qiáng)了。當(dāng)SiO2微球到達(dá)一定的濃度后，Cy3溶液的吸收不再增強(qiáng)，這是由于高濃度的SiO2微球容易產(chǎn)生聚集，會(huì)降低光程的增加，使得隨機(jī)介質(zhì)的散射能力減弱。

由圖6可以看出，在取相同量SiO2微球單分散液的情況下，粒徑為400 nm的微球比粒徑為200 nm的微球?qū)y3溶液的吸收增強(qiáng)效果更好。在粒徑為400 nm的SiO2微球單分散液與Cy3混合溶液中，SiO2單分散液為10 μL時(shí)，吸收強(qiáng)度取得最大值，約比不含SiO2微球的Cy3水溶液增強(qiáng)了1.82倍。在粒徑為200 nm的SiO2微球單分散液與Cy3混合溶液中，SiO2單分散液為8 μL時(shí)，吸收強(qiáng)度取得最大值，約比不含SiO2微球的Cy3水溶液增強(qiáng)了1.63倍。

圖6 在λ=547 nm處不同濃度、粒徑的SiO2單分散液與Cy3混合的吸收強(qiáng)度

根據(jù)式(3)、式(4)和參數(shù)F=πd3C/6可以得出，隨機(jī)介質(zhì)SiO2微球的濃度C、粒徑d，決定了參數(shù)F的值，C和d越大，則F的值越大，隨機(jī)介質(zhì)間的平均自由路徑lfree則會(huì)變小，形成多階散射狀態(tài)，光程l也隨之增加。但是F也有增加的上限，一旦超過這個(gè)界限，溶液的吸收不再繼續(xù)增強(qiáng)反而會(huì)降低。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，隨著SiO2微球濃度和粒徑的增加，其散射作用不斷增強(qiáng)，Cy3溶液中檢測(cè)的光程l也逐漸增長(zhǎng)，被檢測(cè)的Cy3溶液的吸收明顯增強(qiáng)了1.82倍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，該方法比傳統(tǒng)的吸收光譜檢測(cè)具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限度，為低濃度和短光程的樣品檢測(cè)提供了一種新的方法。