張 君，成溫玉，賈懷杰，牛賢云，程國(guó)鋒，景志忠

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730046）

鼠痘（mouse pox）又名鼠傳染性脫腳病，是由鼠痘病毒（Ectromelia virus，ECTV）感染引起的一種接觸性傳染病，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠和各種嚙齒動(dòng)物可造成嚴(yán)重危害。ECTV屬于脊索動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）、正痘病毒屬（Orthopoxvirus）。ECTV為dsDNA病毒，呈磚型或卵圓形，在胞漿中復(fù)制，是動(dòng)物病毒中最大的DNA病毒。實(shí)驗(yàn)小鼠中BALB/c、DBA/2、DBA2/J和A/J等近交品系對(duì)ECTV易感，而C57BL/6、AKR和129等品系對(duì)ECTV具有一定抗性。研究顯示，在C57BL/6小鼠的14個(gè)抗病毒基因中，有2個(gè)以上基因在ECTV感染時(shí)表達(dá)量上調(diào)，而在BALB/c小鼠中的表達(dá)量下調(diào)，這可能是造成它們對(duì)ECTV易感性差異的主要原因[1]。1929年，ECTV首次在美國(guó)實(shí)驗(yàn)鼠中被分離鑒定，隨后不同毒株在世界各地被分離獲得[2]。其中毒力最強(qiáng)的Moscow株由Sololiv分離，Andrewes1947年報(bào)道[3]。Naval株對(duì)BALB/c小鼠具有高致死性，而使CD-1小鼠的發(fā)病率和死亡率較低[4]。

ECTV在感染小鼠足墊數(shù)小時(shí)后，能轉(zhuǎn)移到腿窩淋巴結(jié)進(jìn)行復(fù)制，之后通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移到血液中，到達(dá)脾臟和肝臟，引起壞死性炎癥。低劑量ECTV具有感染性，并可在實(shí)驗(yàn)小鼠和野生小鼠中持續(xù)傳播[5-8]。感染ECTV的小鼠前期臨床表現(xiàn)為四肢、頭部和尾部腫脹、壞死，后期出現(xiàn)腳趾脫落癥狀。鼠痘分為急性型、慢性型和隱性感染3種類型，其中急性感染中多見(jiàn)肝臟和脾臟的腫脹壞死，在急性發(fā)病期存活的小鼠會(huì)產(chǎn)生膿皰樣皮疹；慢性感染小鼠出現(xiàn)發(fā)育遲緩，生產(chǎn)率下降。

最經(jīng)典的ECTV檢測(cè)方法是病理組織切片電鏡觀察和病毒分離相結(jié)合，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)試驗(yàn)條件要求比較苛刻，不適合大批量檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或免疫組化技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）是常用的免疫學(xué)診斷方法，操作簡(jiǎn)單，具有較好的實(shí)用價(jià)值，但重復(fù)性差，干擾因素較多，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[9-11]。常規(guī)PCR和熒光定量PCR等分子生物學(xué)手段是針對(duì)病原體最常用的定性、定量檢測(cè)方法。本研究基于ECTV主要核蛋白P4b對(duì)應(yīng)的基因片段建立了qRT-PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）方法，可檢測(cè)ECTV感染小鼠后不同組織中的病毒載量，同時(shí)用病理組織切片技術(shù)驗(yàn)證該方法的特異性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6品系小鼠購(gòu)自蘭州大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心；ECTV由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.2 試劑 ExTaq?、DL2000 DNA Marker、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ購(gòu)自大連寶生物公司； DEPC水購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自Thermo公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自Promega公司；DNA片段凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自Axygen公司。

1.3 引物的合成與標(biāo)準(zhǔn)品的制備 參考GenBank中ECTV的P4b基因序列（GenBank登錄號(hào)：951664），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5'-GTAGAACGACGCCAGAATA AGATA-3'；下游引物序列：5'-AGAAGATATCA GACGATCCACAATC-3'，擴(kuò)增片段為189 bp，引物由上海英俊生物工程有限公司合成。采用Thermo病毒基因組提取試劑盒提取感染組織中病毒DNA，以該DNA為模板用常規(guī)PCR擴(kuò)增P4b基因片段序列，克隆至pJET1.2載體，篩選出陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 引物特異性、敏感性及可靠性分析 將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品換算成拷貝數(shù)后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋到107、106、105、104、103、102、101共7個(gè)濃度梯度，在20 μL反應(yīng)體系中分別加入Premix10 μL、10 mol/μL上游引物和下游引物各0.8 μL、模板2 μL、DEPC水6.4 μL，離心混勻后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火40 s、72℃延伸5 min，34個(gè)循環(huán)后；72℃再延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分析引物的特異性和敏感性。同時(shí)以10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，各進(jìn)行3次重復(fù)，分析Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性和可靠性。

1.5 感染小鼠組織的采集及病毒DNA的提取 以感染小鼠足墊方式，用純化的ECTV濾液（3×103個(gè)PFU/只）注射SPF級(jí)C57BL/6小鼠。分別于感染前及感染后d5和d7將小鼠脫頸椎處死，置超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌解剖并收集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及皮膚等組織，裝入無(wú)RNA酶的1.5 mL EP管中，做好標(biāo)記。取10只新的無(wú)RNA酶EP管，稱重，記錄其重量，剪取少量組織放入新的EP管中，再次稱重和記錄。根據(jù)凈重加入適量PBS緩沖液，用電動(dòng)研磨器進(jìn)行徹底研磨后置于-20℃冰箱冷凍，反復(fù)凍融3次后，900×g離心5 min，吸取上清200 μL用Thermo病毒基因組試劑盒提取病毒DNA。

1.6 qRT-PCR方法的建立及其標(biāo)準(zhǔn)曲線 反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ（2×）10 μL、上下游引物各0.8 μL、DEPC水6.4μL、模板2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火 30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線的過(guò)程：95℃ 1 min。從65℃ 開(kāi)始每5 s 溫度升高0.5℃，結(jié)束溫度為95℃。將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品換算成拷貝數(shù)后，采用10倍梯度稀釋方法分別稀釋至107、106、105、104、103、102和101共7個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，在CFX96熒光定量PCR儀中擴(kuò)增，以DEPC水為模板的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)感染小鼠組織中ECTV載量 將提取的病毒基因組用DEPC水稀釋至200 ng/μL，應(yīng)用建立的qRT-PCR方法對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和皮膚中的ECTV載量進(jìn)行檢測(cè)。使用Bio-Rad CFX Manager 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和初步分析，Mirosoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Graphpad Prism 7.02作圖分析。

1.8 感染小鼠病理組織切片的觀察分析 分別于感染前及感染后d5和d7將小鼠脫頸椎處死，在無(wú)菌超凈臺(tái)里解剖，切取適量新鮮肝臟和脾臟，放入4%多聚甲醛中固定。經(jīng)脫水、透明，浸蠟形成蠟塊，切片機(jī)切片后，進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察ECTV感染引起的組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 ECTV qRT-PCR檢測(cè)方法的建立

2.1.1 ECTV qRT-PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后，采用絕對(duì)定量PCR技術(shù)對(duì)ECTV的P4b基因片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線中拷貝數(shù)與Ct值呈線性反比關(guān)系，回歸方程為y=-3.574x+32.740（R2>0.99），擴(kuò)增效率為90.5%（圖1A）。熔解曲線（圖1B）呈現(xiàn)單一峰值，峰窄而尖，峰值為80℃±0.5℃，說(shuō)明引物特異性強(qiáng)。由擴(kuò)增曲線（圖1C）可看出，qRT-PCR可檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)，敏感度高于普通PCR（圖1D）。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 分別以不同濃度（107、105、103、101）的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示組內(nèi)和組間的變異系數(shù)（CV）均小于3%，表明建立的qRT-PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.2 小鼠不同組織病毒分布的含量檢測(cè)

2.2.1 肝臟和脾臟病理變化的觀察結(jié)果 分別于感染后d5和d7收集小鼠肝臟和脾臟組織做病理切片。結(jié)果顯示，肝臟表現(xiàn)為病毒性肝炎，肝細(xì)胞呈大小不等灶狀壞死，周圍浸潤(rùn)大量單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，病變肝臟細(xì)胞存在嗜堿性包涵體；脾臟表現(xiàn)為病毒性脾炎，紅髓和白髓界限相對(duì)清楚，但是白髓區(qū)域縮小，淋巴細(xì)胞無(wú)結(jié)構(gòu)細(xì)顆粒狀壞死，脾臟伴有程度不等的淤血，出血。感染ECTV后d7的小鼠肝臟、脾臟病變嚴(yán)重程度高于感染ECTV后d5的病變程度。

2.2.2 ECTV感染小鼠的組織病毒載量檢測(cè)與分析 以3000個(gè)PFU病毒粒子感染時(shí)，在感染d5時(shí)小鼠皮膚組織中的病毒載量最高，達(dá)6.2×108；脾臟、肝臟次之，達(dá)105左右；肺臟、腎臟和心臟最低，僅為103左右；在感染d7時(shí)，脾臟中的病毒載量變化最大且最高，達(dá)2.78×1010；其次為皮膚和肝臟，分別為1.5×109和1.62×106（圖3）。結(jié)果表明感染d7時(shí)小鼠各組織病毒載量均高于感染后d5的病毒載量。

3 討論

圖1 qRT-PCR方法的建立Fig.1 ECTV quantitative RT-PCR

表1 qRT-PCR組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Intra-assay and inter-assay repeatability test of qRT- PCR

圖2 ECTV感染小鼠的肝臟和脾臟病理變化（HE, 400×）Fig. 2 Pathological changes of liver and spleen of miceinfected with ECTV(HE, 400×)

ECTV屬于痘病毒科、正痘病毒屬，正痘病毒屬有一些具有嚴(yán)格宿主限制性但致病性特別強(qiáng)的病原，如天花病毒和ECTV，還有一些致病性弱但能感染不同宿主的病原，如牛痘病毒和痘苗病毒。痘病毒感染時(shí)，一般存在4種感染性病毒粒子形式，其中胞內(nèi)成熟病毒（intracellular mature virus，IMV），只有當(dāng)細(xì)胞裂解時(shí)才被釋放出來(lái)；細(xì)胞內(nèi)囊膜化病毒（intracellular enveloped virus，IEV）是痘病毒的一種中間形式，由IMV通過(guò)高爾基體外側(cè)膜以出芽方式產(chǎn)生。細(xì)胞相關(guān)的囊膜化病毒（cell associated enveloped virus，CEV）主要負(fù)責(zé)病毒在細(xì)胞間的傳播。細(xì)胞外囊膜化病毒（extracellular enveloped virus，EEV）是病毒在宿主個(gè)體間散播的關(guān)鍵病毒粒子形式。痘病毒的這些屬性和感染機(jī)制決定了其具有易感染，傳播快，發(fā)病急的特點(diǎn)。在大部分痘病毒感染過(guò)程中，皮膚、脾臟和肝臟是機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)的主要器官，也是在病毒復(fù)制和增殖過(guò)程中出現(xiàn)病理變化的主要部位[12]。因此，本研究重點(diǎn)建立檢測(cè)ECTV感染小鼠不同組織病毒載量的qRTPCR方法，并分析與組織病理變化間相關(guān)性。示，感染后d7，小鼠肝臟和脾臟整體病理變化比d5更嚴(yán)重，證實(shí)建立的qRT-PCR方法結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

圖3 ECTV感染小鼠后不同組織得病毒載量Fig.3 Viral load in different tissues of the mice infected with ECTV

綜上所述，本研究成功建立了可快速、特異、高效檢測(cè)小鼠組織中ECTV載量的qRT-PCR方法，能定性、定量檢測(cè)ECTV在各組織中的增殖、分布和消長(zhǎng)情況，為ECTV致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

組織病理變化和病毒血癥是衡量機(jī)體致病程度的重要指標(biāo)，而病毒在組織中的載量是引起機(jī)體發(fā)病的關(guān)鍵因素。牛痘病毒A4L基因比較保守，能編碼一種具有多種生物學(xué)特性的核蛋白，同時(shí)其同源基因P4b在ECTV中也高度保守，因此將P4b作為候選基因建立了檢測(cè)ECTV載量的qRT-PCR方法。通過(guò)檢測(cè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒和感染小鼠不同組織中ECTV的P4b基因序列發(fā)現(xiàn)，本研究建立的qRT-PCR方法具有高度的特異性和敏感性，能檢測(cè)出濃度為10～107copies/μL內(nèi)的樣品，擴(kuò)增效率達(dá)90.0%以上，且可針對(duì)ECTV進(jìn)行特異性快速檢測(cè)。檢測(cè)感染小鼠不同組織病毒載量發(fā)現(xiàn)，皮膚、脾臟和肝臟中病毒載量最高，心臟和腎臟中較低，說(shuō)明ECTV主要在皮膚、脾臟和肝臟細(xì)胞中大量復(fù)制和增殖，并引起不同組織病理變化，這與臨床病理解剖變化特征一致。

應(yīng)用建立的qRT-PCR方法在感染小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和皮膚中均可檢測(cè)到ECTV，但其病毒載量存在明顯差異。同時(shí)，感染后d7時(shí)小鼠組織中病毒載量明顯高于d5的病毒載量。ECTV感染小鼠肝臟和脾臟的病理組織切片結(jié)果顯