侯月娥1，葉 平2，伍建敏1,王鳳求1，趙玉林1，王貴平1，李中圣1

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州511400;2.桂林聯(lián)勤保障中心第二儲(chǔ)備資產(chǎn)管理局，廣州510440）

豬偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染導(dǎo)致的急性、熱性傳染病。除高級(jí)靈長(zhǎng)類以外，PRV能夠感染大部分哺乳動(dòng)物[1]。豬是PRV的天然宿主和貯存宿主，不同日齡的豬感染PRV后表現(xiàn)出不同的癥狀。哺乳仔豬感染PRV后多表現(xiàn)為高熱和神經(jīng)癥狀，常常出現(xiàn)整窩集中發(fā)病，15日齡以內(nèi)的仔豬死亡率可達(dá)100%[2]。隨著日齡的增加，豬感染PRV后死亡率迅速降低，斷奶階段死亡率下降到30%以下。保育育肥豬感染PRV后多見(jiàn)發(fā)熱和呼吸道癥狀，耐過(guò)后生長(zhǎng)遲緩多成為僵豬。母豬初次感染PRV往往呈一過(guò)性發(fā)熱，妊娠母豬會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)死胎等癥狀[3]。PRV已給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。美國(guó)和歐洲各國(guó)通過(guò)使用優(yōu)質(zhì)的基因標(biāo)記疫苗和相應(yīng)的鑒別診斷方法，已很好的控制或凈化了豬偽狂犬病[4-6]。但在多數(shù)發(fā)展中國(guó)家，豬偽狂犬病仍頻繁發(fā)生。我國(guó)PRV仍呈流行趨勢(shì)，嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。對(duì)PRV感染早期進(jìn)行及時(shí)、快速、準(zhǔn)確的診斷，是有效防制豬偽狂犬病的重要前提。

gE、gI和TK基因是PRV的主要毒力相關(guān)基因，世界各國(guó)廣泛使用的PRV基因缺失疫苗多為gE、gI基因缺失表型或gE、TK雙基因缺失表型，以及gE、gI和TK三基因缺失表型[7-9]。PRV傳統(tǒng)診斷方法包括病毒的分離、動(dòng)物接種試驗(yàn)、ELISA、病毒中和試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、膠體金免疫層析試驗(yàn)、血凝與血凝抑制試驗(yàn)以及普通PCR等方法，這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，不能定量，試劑不方便運(yùn)輸?shù)热秉c(diǎn)，給PR早期隱性感染的診斷帶來(lái)一定難度[10]。本研究在實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，將除核酸以外所有試劑加入保護(hù)劑進(jìn)行凍干，更方便快捷，適用于PRV的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，從而為PR的預(yù)防和控制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株及質(zhì)粒 PRV、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）均由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院保存；豬偽狂犬活疫苗科偉凈（HB2000株）和科衛(wèi)寧（HB-98株）購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司；豬偽狂犬活疫苗偽美瑞（Bartha-K61株）購(gòu)自哈爾濱維科生物科技開(kāi)發(fā)公司；豬偽狂犬活疫苗豬克偽（Bartha-K61株）購(gòu)自珠海市安富來(lái)物科技有限公司；大腸桿菌DH5α和pMD-18T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑 體液病毒DNA小量制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司；Taq酶、dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；凍干保護(hù)劑由廣東海大集團(tuán)畜牧和水產(chǎn)研究中心提供。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)PRV（AY170318）的核酸序列，利用Beacon Designer 7設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)針對(duì)PRV gE基因特異性引物和熒光探針（表1），引物和探針由上海Invitrogen公司合成。

表1 PRV的熒光定量PCR探針及擴(kuò)增引物Table 1 PRV primers and fl uorescent probes of real-time PCR

1.4 PRV總核酸提取及模板的制備 參照病毒DNA小量制備試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒傳代細(xì)胞中的總核酸，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PRV基因片段克隆及標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以PRV的DNA為模板，PRV-F/PRV-R（10 pmol/L）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸6 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將切膠純化的PCR產(chǎn)物分別克隆至pMD-18T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-PRV。將陽(yáng)性的重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定，并采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定重組質(zhì)粒濃度，換算成拷貝數(shù)。

1.6 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化PRV的引物和探針終濃度為0.1～0.6 μmol/L，退火溫度為55℃～65℃，以不同濃度配比和不同的退火溫度進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，選擇效果最佳的引物、探針濃度及退火溫度。

1.7 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 將1.5中制備的PRV標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，用不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒作為模板，每個(gè)梯度的質(zhì)粒設(shè)立3個(gè)重復(fù)。使用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)1.6摸索出來(lái)的最適溫度，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

1.8 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性和敏感性檢測(cè)

1.8.1 特異性試驗(yàn) 將提取的不同PRV疫苗株的DNA和CSFV、PRRSV反轉(zhuǎn)錄后的cDNA分別作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

1.8.2 敏感性試驗(yàn) 將測(cè)定好質(zhì)粒濃度的模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，利用PRV凍干檢測(cè)試劑測(cè)定其敏感性。與本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PRV普通PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行敏感性比較。

1.9 反應(yīng)試劑凍干品的制備

1.9.1 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化 將凍干保護(hù)劑稀釋為4組不同的濃度（10、8、5、1.25 μmol/mL），與配制好的反應(yīng)試劑混勻，然后進(jìn)行無(wú)菌分裝，200 μL的8連管中，每管加入100 μL反應(yīng)液（相當(dāng)于20 μL的反應(yīng)體系）。分裝后于－80℃冰箱冷凍3 h，完全冷凍后，開(kāi)蓋放于已經(jīng)調(diào)試好的Triad冷凍干燥器里面進(jìn)行冷凍干燥。待程序停止后，根據(jù)凍干樣品物理性狀選擇最佳的一組。

1.9.2 PRV凍干檢測(cè)試劑的使用方法 將凍干試劑用16 μL滅菌去離子水進(jìn)行溶解，加入2 μL陽(yáng)性對(duì)照品，同時(shí)用滅菌的去離子水作為陰性對(duì)照，每管20 μL，封蓋混勻離心。熒光定量PCR的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)1.6摸索出來(lái)的最適溫度，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

1.10 PRV凍干檢測(cè)試劑保存期試驗(yàn) 將凍干檢測(cè)試劑分別放置于室溫25℃和37℃保存，定期對(duì)其敏感性進(jìn)行檢測(cè)，考察不同保存條件對(duì)敏感性的影響。

1.11 PRV凍干檢測(cè)試劑在手持式熒光PCR儀上的試驗(yàn) 手持式熒光PCR儀為單通道PCR儀，將1.5制備的PRV標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，用不同稀釋梯度的重組質(zhì)粒作為模板，根據(jù)其已有內(nèi)置程序進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)進(jìn)行定性檢測(cè)。

1.12 臨床樣本的檢測(cè)試驗(yàn) 選取經(jīng)過(guò)檢測(cè)的PRV陽(yáng)性樣品30份，PRV可疑樣品27份，未經(jīng)檢測(cè)樣品40份，累計(jì)97份，樣品均來(lái)自廣東省，采用本次構(gòu)建的凍干檢測(cè)試劑對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的靈敏性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以合成的PRV引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，切膠純化回收PCR產(chǎn)物，分別與pMD-18T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-PRV，對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，PRV引物能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段（圖1）。

圖1 PRV陽(yáng)性重組質(zhì)粒的鑒定Fig. 1 Identifi cation of PRV positive recombinant plasmids

2.2 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR反應(yīng)中引物、探針的不同終濃度和不同的退火溫度都會(huì)引起Ct值的不同，PRV-F/PRV-R的終濃度為0.3 μmol/L，探針終濃度為0.2 μmol/L，退火溫度為60℃時(shí)，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)信號(hào)值最強(qiáng)，Ct值最小。

2.3 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 質(zhì)粒濃度為1×106～1×101copies/μL的6個(gè)線性梯度時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性（圖2）。

圖2 PRV TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 The standard curve of TaqMan real-time PCR for PRV

圖3 PRV TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢測(cè)Fig.3 Specifi city of PRV TaqMan real-time PCR

2.4 TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)

2.4.1 特異性試驗(yàn) 將提取的PRV野毒、基因缺失活疫苗的DNA以及CSFV和PRRSV病毒核酸反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僅PRV野毒的熒光信號(hào)為陽(yáng)性，其他疫苗株和另外兩種病毒的檢測(cè)均為陰性，說(shuō)明建立的TaqMan熒光定量PCR特異性較強(qiáng)，與其他病毒的基因沒(méi)有交叉反應(yīng)，可用于臨床野毒檢測(cè)（圖3）。

2.4.2 PRV TaqMan熒光定量real-time PCR敏感性試驗(yàn) 對(duì)PRV的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最低檢測(cè)量為10 copies/μL（圖4）。與實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的PRV普通PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是普通PCR敏感性的100倍（圖5）。

圖4 PRV實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性檢測(cè)Fig.4 Sensitivity of PRV TaqMan real-time PCR

圖5 普通PRV標(biāo)準(zhǔn)品敏感性試驗(yàn)Fig.5 Sensitivity of the normal PCR for PRV detection

2.5 PRV凍干保護(hù)劑的優(yōu)化 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示保護(hù)劑濃度達(dá)到8 μm/mL時(shí)，和不加保護(hù)劑的反應(yīng)Ct值相同（圖6），故將保護(hù)劑濃度定為8 μm/mL。該組凍干形態(tài)上也較好（圖7）。

2.6 PRV凍干檢測(cè)試劑保存期試驗(yàn) 結(jié)果顯示在室溫25℃下存放6個(gè)月，37℃存放15 d和最初的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有差異，敏感性都可以達(dá)到10 copies/μL（表2）。由此說(shuō)明，PRV的凍干檢測(cè)試劑在這兩種存放條件下的敏感性并未降低，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.7 手持式熒光PCR儀檢測(cè)結(jié)果和熒光定量PCR結(jié)果的比較 利用PRV凍干檢測(cè)試劑，采用手持式熒光PCR儀對(duì)PRV標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性檢測(cè)，并與TaqMan熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示手持式熒光PCR儀檢測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果相一致，表明凍干檢測(cè)試劑也可以應(yīng)用于手持式熒光PCR儀。

圖6 PRV凍干保護(hù)劑的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the freeze-dried protective agent

圖7 PRV 凍干檢測(cè)試劑凍干后的物理性狀Fig.7 The physical characters of the freeze-dried detection reagent for PRV

表2 PRV凍干檢測(cè)試劑不同保存條件下的敏感性試驗(yàn)Table 2 Specifi city of the freeze-dried detection reagent after storage under different conditions

2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)30份普通PCR鑒定的已知臨床病料和27份可疑臨床病料，以及未知的40份病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，30份陽(yáng)性病料，病毒拷貝數(shù)在4.1×104～2.1×107copies/μL（超過(guò)以及等于106copies/μL的樣品，均稀釋100后再次檢測(cè)），符合率為100%。27份可疑病料檢測(cè)結(jié)果顯示9份感染PRV，病毒拷貝數(shù)在1.3×102～3.7×103copies/μL，陽(yáng)性率為33.33%。40份未驗(yàn)證病料的檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性感染的有18份，病毒拷貝數(shù)在2.7×102～6.4×108copies/μL，感染率為45%，而普通PCR僅檢測(cè)出11份，感染率為27.5%。

表3 手持式熒光PCR儀和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的比較Table 3 Comparison of detection result of handheld real-time PCR device and TaqMan real-time PCR

3 討論

豬偽狂犬病是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一，可引起母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，初生仔豬大批死亡，成年豬則呈隱性感染，長(zhǎng)期帶毒排毒，并且同引起繁殖障礙疾病的病毒病臨床癥狀相似，容易產(chǎn)生其他細(xì)菌性疾病的繼發(fā)感染，使病情惡化不利于臨床診斷。豬偽狂犬病嚴(yán)重影響種豬場(chǎng)生產(chǎn)及優(yōu)良品種的推廣，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失[11]。因此，對(duì)PRV進(jìn)行快速、及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，是有效防治PR的重要前提。PRV檢測(cè)方法有病毒分離、gE抗體檢測(cè)、常規(guī)PCR檢測(cè)、中和試驗(yàn)、細(xì)胞免疫等，但這些方法耗時(shí)較長(zhǎng)，敏感性和特異性存在不足。熒光定量PCR不僅可對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)，而且靈敏度高，特異性強(qiáng)，實(shí)時(shí)性好，耗時(shí)短，自動(dòng)化程度高，能同時(shí)檢測(cè)多份樣品[12]。定量檢測(cè)可以對(duì)疫病進(jìn)行預(yù)警預(yù)報(bào)，為防控和治療贏得時(shí)間，并且在研究病毒對(duì)機(jī)體持續(xù)性感染方面具有重要意義[13-14]。

冷凍干燥技術(shù)是提高生物制品穩(wěn)定性的通用方法，也為分子診斷試劑的長(zhǎng)期保存提供了有效途徑[15]。本研究通過(guò)對(duì)PRV gE基因的保守序列進(jìn)行了特異性的探針和匹配引物的設(shè)計(jì)，并對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了反復(fù)調(diào)整和優(yōu)化，最終確定了最佳反應(yīng)條件。在優(yōu)化的基礎(chǔ)上將除核酸以外的所有成份（含保護(hù)劑）進(jìn)行冷凍干燥。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果最終確定了最佳保護(hù)劑組合和凍干條件。干燥好的凍干檢測(cè)試劑可以常溫運(yùn)輸和短時(shí)間保存，不會(huì)影響其性能，直接用滅菌的去離子水進(jìn)行溶解后，添加所需檢測(cè)的DNA，置于熒光定量PCR儀，通過(guò)分析軟件能直觀詳細(xì)記錄整個(gè)PCR過(guò)程，不需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和瓊脂糖凝膠電泳，有效減少假陽(yáng)性和污染發(fā)生，并且簡(jiǎn)單快捷，對(duì)工作人員的專業(yè)要求不高。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以直接從軟件上得到病毒的準(zhǔn)確拷貝數(shù)。

趙麗等[16]和田云等[17]建立的PRV熒光定量檢測(cè)方法特異性和敏感性均較好，但是操作繁瑣，試劑必須低溫保存，不方便運(yùn)輸，不便于普及。本研究制備的凍干檢測(cè)試劑可以在常溫下操作而不影響其敏感性，也可以利用手持式熒光PCR儀來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。本研究基于TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，結(jié)合核酸擴(kuò)增體系凍干工藝制備的PRV PCR凍干試劑彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法重復(fù)性和耗時(shí)長(zhǎng)的不足，同時(shí)具有較高的特異性，對(duì)于PRV早期診斷，致病機(jī)理研究以及防控技術(shù)研究等具有重要意義。