白銀榮，張志飛，李雪松，劉芹防，陳鴻軍，楊健美，李澤君，滕巧泱，張七斤

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）是Ⅲ型馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV），屬于皰疹病毒科、皰疹病毒甲亞科、馬立克氏病毒屬，為線性雙鏈DNA病毒[1]。HVT是細(xì)胞結(jié)合性皰疹病毒，能夠感染雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）并產(chǎn)生病變。雞感染HVT后可終生攜帶，但是無(wú)致病性[2-3]。自20世紀(jì)70年代HVT被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直作為活疫苗預(yù)防MDV感染，效果良好[4]。目前，HVT活疫苗已廣泛地應(yīng)用于1日齡雛雞來(lái)預(yù)防馬立克氏病[5-6]。

在體外，通常采用蝕斑技術(shù)對(duì)HVT疫苗免疫效力和增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，但該方法準(zhǔn)確性低，重復(fù)性差，易受許多因素的影響，而且操作繁瑣，周期長(zhǎng)，很難應(yīng)用于大量樣品的快速檢測(cè)。本研究擬建立一種快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異且準(zhǔn)確的HVT熒光定量PCR檢測(cè)方法，為及時(shí)檢測(cè)HVT的病毒含量提供有效的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株、SPF雞胚和CEF細(xì)胞 火雞皰疹病毒FC-126疫苗凍干毒購(gòu)自哈爾濱獸藥廠；鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV）、傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）、血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)ADV4）和FADV8均由本實(shí)驗(yàn)室提供；SPF雞胚由北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；采用9～11日齡SPF雞胚制備原代細(xì)胞。

1.1.2 載體和受體菌 pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 2×HieffTMPCR Master Mix購(gòu)自 圣生物公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）購(gòu)自TaKaRa公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；DMEM購(gòu)自Hyclone公司；0.25%胰酶購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Biosun公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自Eppendorf公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司；UV-2000型紫外分析割膠儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI登錄的HVT FC-126毒株（AF281966）的sorf1基因序列，應(yīng)用Beacon Designer 8設(shè)計(jì)特異性引物和探針（表1）。引物和探針由上海華津生物科技有限公司合成。

表1 引物和探針信息Table 1 The sequences of primers and probe

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 在CEF上擴(kuò)增病毒，病變達(dá)到80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞并提取總DNA，具體方法參照Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒說(shuō)明書。以提取的HVT基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增sorf1基因。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 19 μL、2×HieffTMPCR Master Mix 25 μL、上游引物（10 μmol/L）2 μL、下游引物（10 μmol/L）2 μL、DNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸10 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，連接于pMD19-T載體。PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液送上海擎科生物公司測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，命名為p-sorf1。測(cè)定質(zhì)粒濃度后用公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，10倍梯度稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品，即濃度分別為1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL。

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 在同一濃度模板的反應(yīng)體系中，采用正交試驗(yàn)法對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。以1.4中經(jīng)10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件，在Mastercycler?RealPlex2熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，獲得模板拷貝數(shù)與臨界循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 敏感性 將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。通過(guò)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，判定該方法所能檢測(cè)的最小DNA拷貝數(shù)。以梯度稀釋的質(zhì)粒為模板，HVT-F和HVT-R為引物（表1），采用常規(guī)PCR方法來(lái)擴(kuò)增HVT，用1%瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.7 特異性 分別以DPV、ILTV、GPV、FADV4和FADV8的基因組DNA為模板，設(shè)空白對(duì)照，按優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 選取1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106copies/μL 5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行組間和組內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)。

1.9 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采集的82份樣品按1.4中方法提取基因組DNA，分別使用建立的HVT熒光定量PCR方法以及常規(guī)PCR方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備及鑒定 普通PCR可擴(kuò)增出約85 bp的特異性條帶，與目的片段大小一致（圖1）。將該片段連接于pMD19-T載體，獲得重組質(zhì)粒p-sorf1，測(cè)序結(jié)果顯示與原序列完全一致。提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度為62 ng/μL，OD260/OD280比值為1.98，符合純度要求。經(jīng)公式：Copy Number = ( amount× 6.022×1023) /(length×1×109×660)，計(jì)算出陽(yáng)性重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為2.0×1010copies/μL。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)優(yōu)化后最終確定的PCR反應(yīng)體系：ddH2O 6.4 μL、2×Premix ExTaq10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.6 μL、下游引物（10 μmol/L）0.6 μL、探針（10 μmol/L）0.4 μL、模板2 μL。最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。將p-sorf1質(zhì)粒梯度稀釋后制備標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋濃度分別為1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/μL。以各個(gè)濃度的質(zhì)粒作為模板，經(jīng)qPCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=-3.42logx+41.21（圖2），相關(guān)系數(shù)R2為0.999，說(shuō)明建立的qPCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好；擴(kuò)增效率為107%，產(chǎn)物的Ct值與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 sorf1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of sorf1 gene

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of fl uorescence quantitative PCR

2.3 敏感性分析 將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL為模板，利用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性的最高稀釋度的質(zhì)粒濃度為1×102copies/μL（圖3），而普通PCR檢測(cè)的靈敏度為1×103copies/μL（圖4），可見(jiàn)，熒光定量PCR的敏感性是普通PCR的10倍。2.5 特異性分析 檢測(cè)結(jié)果表明，應(yīng)用建立的TaqMan熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，僅HVT有特異性擴(kuò)增曲線，而DPV、ILTV、GPV、FAdV-4和FAdV-8均為陰性（圖5），表明該方法具有良好的特異性。

圖3 熒光定量PCR的敏感性檢測(cè)Fig.3 Sensitivity of fl uorescence quantitative PCR

圖4 常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Result of the conventional PCR

圖5 熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.5 Specifi city of fl uorescence quantitative PCR

2.6 重復(fù)性分析 將重組質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取濃度為1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106copies/μL的重組質(zhì)粒作為模板，驗(yàn)證建立的熒光定量PCR方法的重復(fù)性。由表2可知，組間和組內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，表明本研究所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

表2 熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性Table2 Repeatability of fl uorescence quantitative PCR

2.7 臨床樣品檢測(cè) 分別使用建立的HVT熒光定量PCR方法和普通PCR方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)制備的82份HVT病毒樣品進(jìn)行檢測(cè)。以p-sorf1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，超純水為空白對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢測(cè)出43份陽(yáng)性樣品，普通PCR檢測(cè)出30份陽(yáng)性樣品，進(jìn)一步證實(shí)建立的熒光定量PCR方法較普通PCR更敏感。

3 討論

HVT與馬立克氏病毒在遺傳學(xué)和血清學(xué)上具有相關(guān)性，一直作為活疫苗用于預(yù)防馬立克氏病[4,7]。同時(shí)，HVT作為載體攜帶外源保護(hù)性抗原具有許多優(yōu)勢(shì)：對(duì)雞和其他動(dòng)物無(wú)致病性，較為安全；接種后雞體能產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的病毒血癥，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平；HVT疫苗生產(chǎn)成本低，可凍干，貯存和運(yùn)輸方便[8-9]。國(guó)內(nèi)外對(duì)以HVT為載體的禽病重組疫苗已開展了大量的研究，如傳染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD），新城疫（newcastle disease，ND）和禽流感（avian influenza，AI）等[10]。快速、準(zhǔn)確有效地判斷HVT在細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)的復(fù)制情況，是HVT載體疫苗研究的重要基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)條件優(yōu)化，最終建立了較為理想的HVT熒光定量PCR檢測(cè)方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999，線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率為107%（擴(kuò)增效率應(yīng)為0.8～1.2，以接近1為最佳）。該方法可特異性檢測(cè)到HVT，靈敏度較普通PCR提高1個(gè)數(shù)量級(jí)，提高了檢測(cè)病原的敏感性。檢測(cè)臨床樣品時(shí)，建立的HVT熒光定量PCR檢測(cè)方法較普通PCR的方法的檢測(cè)率提高了16%。結(jié)果表明，本研究所建立的HVT熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有較好的準(zhǔn)確性、特異性和敏感性，為評(píng)估HVT免疫情況及其新型疫苗的后續(xù)研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。