孟 婷，朱善元，夏文龍，左偉勇，王永娟

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300）

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）感染引起的以腹瀉和喘氣為主要癥狀的急性或亞急性傳染病[1-3]。該病主要危害30 日齡以內(nèi)的雛番鴨，特別是1～3 周齡的雛番鴨，因此俗稱“三周病”。MDPV傳播迅速，常引起鴨群發(fā)病和成群死亡，發(fā)病率和死亡率都很高。日齡較大的雛鴨感染MDPV后一般癥狀較輕，病死率較低，但病愈后大部分生長(zhǎng)發(fā)育受阻，成為僵鴨。目前番鴨細(xì)小病毒病已經(jīng)成為危害我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的傳染病之一[4-6]。MDPV檢測(cè)方法中血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等[7]方法靈敏性低，周期長(zhǎng)，重復(fù)性差，不易標(biāo)準(zhǔn)化，難以大范圍推廣使用；常規(guī)PCR和熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑往往比較昂貴，對(duì)操作員要求較高，不能滿足基層獸醫(yī)站或養(yǎng)殖場(chǎng)臨床一線簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)的需要[8]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，它依賴于能夠識(shí)別靶序列6 個(gè)特異區(qū)域的4 條引物和一種具有解旋功能的BstDNA聚合酶，能夠在恒定溫度下，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。LAMP以其簡(jiǎn)便、快速、高效、靈敏、特異等諸多優(yōu)點(diǎn)受到越來(lái)越多獸醫(yī)工作者的關(guān)注，并在一些病原微生物的檢測(cè)中得到應(yīng)用推廣[9-11]。本研究通過(guò)對(duì)MDPV的VP3基因保守序列的分析，設(shè)計(jì)了一組特異性引物，建立了MDPV的LAMP快速檢測(cè)方法，為將來(lái)MDPV的快速檢測(cè)試劑盒研制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株 鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）、鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）和番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；小鵝瘟病毒（Goose parvovirus, GPV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保存于-80℃。

1.2 試劑及器材BstDNA聚合酶（大片段）、SYBR Green I 染料購(gòu)自New England Biolabs公司；MgSO4、甜菜堿購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTP、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司； DEPC水購(gòu)自Sigma公司；2×LAMP Master Mix（含染料）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)MDPV的VP3基因序列（GenBank登錄號(hào)：AY496895.1），選取一段高度保守的區(qū)域，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上游引物F和下游引物R（表1）；使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設(shè)計(jì)LAMP引物，其中包括2條外引物F3/R3以及2 條內(nèi)引物FIP/RIP。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequences

1.4 病毒核酸的提取 參照上海生工柱式病毒抽提純化試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別提取番鴨細(xì)小病毒（MDPV）、鴨肝炎病毒（DHV）、新城疫病毒（NDV）、小鵝瘟病毒（GPV）和鴨瘟病毒（DPV）的基因組，將DHV和NDV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有DNA/cDNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LAMP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

1.5.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化 在總反應(yīng)體系25 μL，模板1 μL的條件下，依次對(duì)LAMP反應(yīng)體系中的鎂離子濃度、引物濃度、dNTPs濃度、甜菜堿濃度進(jìn)行優(yōu)化，具體濃度比例如下：鎂離子濃度為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mmol/L；內(nèi)引物濃度為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 μmol/L；dNTPs濃度為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；甜菜堿濃度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。反應(yīng)液均在冰盒上配制，輕輕混勻后瞬時(shí)離心，于65℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)90 min，反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)液進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.5.2 最佳反應(yīng)溫度的確定 優(yōu)化后的反應(yīng)體系分別在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃溫度下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)束后吸取10 μL反應(yīng)液進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.5.3 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 優(yōu)化后的反應(yīng)體系分別反應(yīng)15、30、54、60、75、90 min，結(jié)束后吸取10 μL反應(yīng)液進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.6 PCR方法的建立 以提取的MDPV核酸為模板，采用引物PCR-F / PCR-R（見(jiàn)表1）進(jìn)行VP3基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×LAMP Master Mix（含染料）12.5 μL、核酸模板1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。

1.7 LAMP的靈敏性檢驗(yàn) 將抽提的MDPV核酸模板進(jìn)行10 倍梯度稀釋，最終為1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4ng/μL，分別以各稀釋度核酸DNA作為模板，按照前期優(yōu)化好的LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)。同時(shí)取各稀釋度的核酸模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，比較兩者的靈敏性。

1.8 LAMP的特異性試驗(yàn) 分別以MDPV、DHV、NDV、GPV和DPV的DNA/cDNA為模板，利用本研究建立的LAMP進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的調(diào)整優(yōu)化，最終確定LAMP反應(yīng)體系為25 μL：8 U/μLBstDNA聚合酶、2.5 μL 10×Bst buffer、4 μL 25 mmol/L MgSO4、2 μL 20 μmol/L FIP/RIP、0.5 μL 20 μmol/L F3/R3、2 μL 25 mmol/L dNTPs、2 μL 5 mol/L 甜菜堿、1 μL 模板DNA，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL；63℃反應(yīng)60 min為最優(yōu)反應(yīng)條件（圖1）。

2.2 LAMP方法靈敏性檢測(cè) 以提取的MDPV核酸為模板，PCR擴(kuò)增部分VP3 基因序列，電泳結(jié)果顯示在900 bp左右可見(jiàn)一清晰條帶，與預(yù)期相符（圖略）。所建立的LAMP方法對(duì)MDPV DNA的最低檢測(cè)限為1×10-2ng/μL（圖2A），與建立的PCR方法相同（圖2B）。

圖1 LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化Fig.1 Optimization of LAMP reaction system

2.3 LAMP方法特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用建立的LAMP方法分別對(duì)MDPV、DHV、NDV、GPV和DPV的DNA/cDNA模板進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示，建立的LAMP僅對(duì)MDPV擴(kuò)散出特異性條帶，其他均為陰性。

圖2 PCR(A)和LAMP(B)方法檢測(cè)MDPV的靈敏性比較Fig.2 Sensitivity analysis of LAMP assay(A) and PCR assay(B) for MDPV

圖3 LAMP方法檢測(cè)MDPV的特異性Fig.3 Specifi city of LAMP assay for MDPV

3 討論

近年來(lái)，番鴨細(xì)小病毒病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的危害日益嚴(yán)重。但是，目前尚無(wú)針對(duì)本病的特異性治療方法，盡快發(fā)現(xiàn)并隔離病鴨或帶毒鴨，提早預(yù)防是控制疫情的有效方法。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便的診斷方法顯得尤為重要。

本研究通過(guò)對(duì)MDPV的VP3基因保守序列的分析，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了一組特異性的引物，對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行逐一優(yōu)化調(diào)整，建立了MDPV的LAMP快速檢測(cè)方法。從病料處理、核酸提取、等溫?cái)U(kuò)增到最終結(jié)果判定可在1.5 h內(nèi)完成，與PCR和熒光定量PCR相比，用時(shí)縮短了一半以上，更加適應(yīng)臨床一線對(duì)快速檢測(cè)的需要。LAMP所用BstDNA聚合酶在恒溫條件下具有核酸擴(kuò)增作用，有效避免了Taq酶在反應(yīng)過(guò)程中必須精確升降溫的弊端。

綜上所述，本研究建立的LAMP檢測(cè)方法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快捷等特點(diǎn)，適用于野外或臨床一線的快速檢測(cè)。同時(shí)，也為其他相關(guān)病原的檢測(cè)提供了新的思路和方法。