潘 學(xué)，陳新武，季雅寧，李雪松，劉芹防，陳鴻軍，楊健美，滕巧泱，李澤君

禽流感（avian influenza，AI）是由正粘病毒科A 型流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類高度接觸性傳染病，有16個HA亞型和9個NA 亞型[1]。根據(jù)禽流感病毒致病性的不同，可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，中國的低致病性禽流感疫情主要以H9亞型為主。1994 年首次在雞群中分離到H9N2亞型AIV[2]，該亞型AIV廣泛存在于我國大部分地區(qū)[3]。H9N2 亞型AIV雖然不能造成禽類大量死亡，但是由于該病毒傳播能力極強，存在范圍極廣，可導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降和免疫抑制病，并且AIV與其他病原共感染時常導(dǎo)致高死亡率，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

接種疫苗是預(yù)防禽流感發(fā)生與傳播最有效的手段之一。上海市動物疫病預(yù)防控制中心2009年監(jiān)測報告顯示[4]，在上海三大活禽批發(fā)市場采集的樣品中，H9亞型AIV平均陽性率為8.14%，并且在免疫H9N2亞型AIV滅活苗后抗體合格率達到100%的樣品中分離到8株H9亞型AIV(8/90)。2009～2010年對禽流感流行病學(xué)的研究顯示，H9抗體較高的免疫雞依然攜帶H9N2亞型AIV?，F(xiàn)有的H9N2亞型AIV滅活疫苗免疫雞后，雖然能使雞產(chǎn)生較高的抗體，但已經(jīng)不能有效地保護其免受當(dāng)前H9N2亞型AIV流行株的攻擊。因此，商品化H9N2亞型AIV滅活疫苗的制備毒株急需更新。

病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）疫苗因其安全性和抗病毒的有效性，成為近年研究的熱點[5]。目前，已經(jīng)有乙型肝炎病毒和人類乳頭瘤病毒VLP疫苗上市[5-6]。VLP沒有病毒核酸，不能自主復(fù)制，非常安全。VLP在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，作為顆粒性抗原可激活樹突狀細胞等抗原提呈細胞，被其提呈給T、B淋巴細胞，從而有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫保護反應(yīng)。同時，VLP具有廣泛的交叉免疫作用，這一點是應(yīng)對當(dāng)前流感病毒抗原變異快速的關(guān)鍵[7-9]。與傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)方式相比，VLP疫苗還具有反應(yīng)快速的優(yōu)勢。目前，國外研究人員利用桿狀表達系統(tǒng)平臺，已經(jīng)成功制備了H1N1、H3N2、H5N1、H5N3等亞型流感病毒的VLPs[8-11]。研究結(jié)果顯示，僅需流感病毒的HA和NA兩個蛋白，即可完成流感VLPs的合成和出芽[12-13]。

本研究將H9N2亞型AIV的HA和NA基因優(yōu)化成昆蟲細胞所偏嗜的密碼子，通過桿狀病毒表達系統(tǒng)成功的表達出只有HA和NA蛋白所構(gòu)成的VLP，優(yōu)化了VLP形成的條件，為H9N2亞型AIV的VLP疫苗產(chǎn)品研發(fā)及其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞、感受態(tài)、載體 H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)（簡稱為SH441）由上海獸醫(yī)研究所動物流感病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團隊保存，前期研究表明該病毒具有良好的免疫原性；草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9細胞系由上海獸醫(yī)研究所動物流感病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團隊保存；E.coli DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；DH10Bac感受態(tài)細胞購自上海超研生物科技有限公司；pFastBackTMDual桿狀病毒表達質(zhì)粒由上海獸醫(yī)研究所動物流感病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團隊保存。

1.2 主要試劑 Sf-900TMII SFM昆蟲細胞培養(yǎng)基、Cellfectin? II Reagent轉(zhuǎn)染試劑、S.O.C. Medium、PureLinkTMHiPure Plasmid Miniprep Kit、Grace’s Insect Cell Culture Medium（Unsupplemented）、Grace’s Insect Cell Culture Medium（Supplemented）、500 mL三角瓶均購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Gibco公司；Sal I、Xba I、Nhe I和Xho I等限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；同源重組酶ClonE press II購自北京全式金公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.3 病毒RNA的提取和RT-PCR擴增 按照天根生化科技有限公司抽提RNA試劑盒的說明書抽提總RNA，隨后用12 bp通用引物（表1）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用同源重組特異性引物pFast-HA-F、pFast-HA-R 和pFast-NA -F 、pFast-NA-R（表1），經(jīng)TaKaRa高保真聚合酶（pyrobest DNA polymerase ）擴增得到毒株SH441的HA和NA開放閱讀框。

1.4 H9N2亞型AIV的HA和NA基因的優(yōu)化與合成 將H9N2亞型AIV毒株SH441的HA和NA開放閱讀框的密碼子，按照昆蟲細胞所偏嗜的密碼子進行優(yōu)化后，由金唯智生物科技有限公司合成并克隆至pMD-19T載體。以上述重組質(zhì)粒為模板，利用同源重組特異性引物opti-pFast-HA-F、opti-pFast-HA-R和opti-pFast-NA-F、opti-pFast-NA-R（表1），經(jīng)pyrobest DNA polymerase擴增得到優(yōu)化后的HA和NA目的片段，分別命名為optiHA和optiNA。

表1 PCR所用引物Table1 The primers for PCR

1.5 含有目的基因的重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將pFastBackTMDual載體用SalI和XbaI雙酶切，制備線形載體，酶切產(chǎn)物膠回收后，利用同源重組試劑盒分別將經(jīng)相同酶切的NA或optiNA連接至線形載體pFastBackTMDual，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并分別命名為pFastBackTMDual-NA和pFastBackTMDual-optiNA。隨后構(gòu)建的質(zhì)粒分別經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后，利用同源重組酶將HA連接至pFastBackTMDual-NA質(zhì)粒，命名為pFastBackTMDual-HANA；將optiHA連接至opti-pFastBackTMDual-NA質(zhì)粒，命名為pFastBackTMDual-optiHANA。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于 DH5α 感受態(tài)細胞，挑取單克隆。提取質(zhì)粒分別用特異性引物進行PCR鑒定，并進行測序驗證。PCR鑒定過程中所用到的特異性引物：pFast-HA-F、pFast-HA-R、pFast-NA-F、pFast-NA-R、opti-pFast-HA-F、opti-pFast-HA-R和opti-pFast-NA-F、opti-pFast-NA-R（表1）。

1.6 含有目的基因的重組桿粒的構(gòu)建與鑒定 將供體質(zhì)粒pFastBackTMDual-HANA和pFastBackTMDualopti HANA分別轉(zhuǎn)化到含有Bacmid和 Helper質(zhì)粒的大腸桿菌 DH10Bac 感受態(tài)細胞中，經(jīng)3次的抗性和藍白斑篩選，挑取白色單個克隆，再次劃線于新鮮LB 平板，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取白色單個克隆，擴大培養(yǎng)后提取DNA，分別命名為Bacmid-

HANA和Bacmid-optiHANA，使用特異性引物進行 PCR 鑒定。PCR鑒定所用的特異性引物：pFast-HA-F、pFast-HA-R、pFast-NA-F、pFast-NA-R、opti-pFast-HA-F、opti-pFast-HA-R和opti-pFast-NA-F、opti-pFast-NA-R。

1.7 重組桿狀病毒的獲得 按照 Invitrogen 公司 Bacto-Bac Baculovirus Expression System 技術(shù)手冊使用Cellfectin reagent，分別將Bacmid-HANA和BacmidoptiHANA轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細胞，27℃培養(yǎng) 3～5 d，直至 70%～80%細胞出現(xiàn)病變，收獲培養(yǎng)上清和細胞，300×g離心15 min，上清即為原代毒種（P1 代），4℃避光保存?zhèn)溆谩1代毒種在Sf9昆蟲細胞上擴大培養(yǎng)1次后即為P2代毒種，測定病毒滴度后，將病毒分裝，保存于4℃或－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 Western blot 鑒定目的蛋白表達 Sf9昆蟲細胞生長至 80%～90%時，接種P2代重組桿狀病毒，27℃培養(yǎng)3～5 d，直至70%～80%的細胞出現(xiàn)病變，收獲培養(yǎng)上清和細胞，300×g離心15 min。將收獲的樣品用樣品緩沖液重懸，煮沸 5 min，經(jīng)10%SDSPAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，用5%的脫脂乳室溫封閉2 h。加入抗H9N2亞型禽流感病毒的雞血清（1∶1000稀釋）作為一抗，置于4℃搖床過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶2000稀釋的HRP羊抗雞IgG（Sigma）作為二抗。TBST洗膜3次，每次10 min，共3次，將膜置于發(fā)光液中浸泡約1 min，然后曝光。

1.9 VLP的超離與純化 將4瓶長滿T75細胞瓶中的Sf9昆蟲細胞完全轉(zhuǎn)移到一次性500 mL三角瓶中，加200 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。然后接種重組桿狀病毒，27℃、110 r/min培養(yǎng)36 h后，4℃、300×g離心，去除細胞脆片及雜質(zhì)。收集上清，置于超速離心機，4℃、159 930×g離心 6 h。離心后輕輕棄去上清，用 200 μLPBS重懸沉淀物并混勻，過蔗糖梯度（40%、50%、60%三種不同濃度）后，4℃、159 930×g離心6 h。吸取不同濃度蔗糖之間的病毒條帶于新的離心管中，加入適量的PBS以洗脫蔗糖，沉淀用100 μL去離子水重懸。

1.10 透射電子顯微鏡觀察VLP形態(tài) 將超離純化的VLP進行50倍稀釋后，固定于銅網(wǎng)，用磷鎢酸復(fù)染，于透射電子顯微鏡下（日本 GEM2100）觀察。

2. 結(jié)果

2.1 H9N2亞型AIV的HA和NA基因的密碼子優(yōu)化 由于不同宿主所偏嗜的密碼子不同，因此將H9N2亞型AIV毒株SH441 HA和NA的開放閱讀框的密碼子優(yōu)化成昆蟲細胞所偏嗜的密碼子，并分別命名為opti-HA（圖1A）和opti-NA（圖1B）。

2.2 pFastBack重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 為了在桿狀病毒系統(tǒng)中表達H9N2亞型AIV的HA和NA蛋白，我們利用同源重組的方法構(gòu)建了兩種不同的質(zhì)粒：pFastBackTMDual-HANA和pFastBackTMDualoptiHANA。獲得的重組質(zhì)粒用SalI、XbaI、NheI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切處理，皆得到與預(yù)期大小相符的片段（圖2）。

2.3 Bacmid重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 將供體pFastBackTMDual-HANA和pFastBackTMDual-optiHANA轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，獲得了相應(yīng)的Bacmid重組質(zhì)粒，分別命名為Bacmid-HANA和BacmidoptiHANA。以提取的重組質(zhì)粒DNA為模板，用相應(yīng)的特異性引物進行PCR，結(jié)果顯示，在1000～2000 bp之間出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖3）。測序結(jié)果也表明，該質(zhì)粒中含有的目的基因片段與預(yù)期序列完全一致，所構(gòu)建的載體是正確的。

圖1 HA和NA基因的密碼子優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimized codons for HA gene(A) and NA gene(B)

圖2 重組質(zhì)粒pFastBackTM Dual-optiHANA和pFastBackTM Dual-HANA的PCR鑒定Fig. 2 PCR identifi cation of pFastBackTM Dual-optiHANA and pFastBackTM Dual-HANA

圖3 rBacmid-optiHANA和rBacmid-HANA的PCR鑒定Fig.3 PCR identifi cation of rBacmid-optiHANA and rBacmid-HANA

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞病變結(jié)果 利用Cellfectin?II Reagent轉(zhuǎn)染試劑分別將1 μg的Bacmid-HANA和Bacmid-optiHANA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細胞中，每天觀察細胞病變，并在轉(zhuǎn)染后12、24、36、48、72 h測血凝。轉(zhuǎn)染72 h，Bacmid-HANA和BacmidoptiHANA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞均產(chǎn)生細胞病變（圖4）。進一步研究表明，Bacmid-optiHANA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞上清中檢測到血凝，HA效價為24，而未經(jīng)優(yōu)化的Bacmid-HANA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞上清中未檢測到血凝。結(jié)果表明，插入優(yōu)化的HA和NA基因的Bacmid重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Sf9細胞后不但能形成重組桿狀病毒，而且表達分泌型的HA蛋白和NA蛋白到細胞上清中。插入未經(jīng)優(yōu)化的HA和NA基因的Bacmid重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Sf9細胞后可形成重組桿狀病毒，但無法表達分泌型的HA蛋白和NA蛋白到細胞上清中。

圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞后的病變Fig.4 Pathological changes of Sf9 cells transfected with recombinant plasmids

2.5 Western blot檢測目的蛋白的表達 將重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，感染后72 h收集上清，用抗H9N2亞型AIV的雞血清作為一抗和HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG作為二抗，進行Western blot分析。結(jié)果顯示，插入優(yōu)化的HA和NA基因的桿狀重組病毒感染Sf9細胞后，在55～70 kDa之間有兩條特異性條帶，與預(yù)期的大小基本一致，但插入未優(yōu)化的HA和NA基因的桿狀重組病毒未能在Sf9細胞中表達目的蛋白（圖5）。

2.6 透射電子顯微鏡觀察流感病毒樣顆粒 將插入優(yōu)化的HA和NA基因的桿狀重組病毒感染Sf9細胞，離心獲得的上清經(jīng)超速離心法濃縮后，再用蔗糖梯度離心的方法純化，然后在透射電子顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，桿狀重組病毒感染Sf9細胞后的上清中可以觀察到病毒樣顆粒，并且形態(tài)呈多樣性（圖6），與野生型的流感病毒特性一致。

3 討論

不同的宿主對密碼子的偏愛性不同，所以不同宿主使用不同密碼子的頻率不同，導(dǎo)致異源基因的表達受宿主的影響[14]。將Sf9 細胞偏嗜的密碼子與人類偏嗜的密碼子進行比較，發(fā)現(xiàn)兩者絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及終止密碼子等均不同[15]。研究表明，密碼子優(yōu)化后所表達的流感病毒蛋白的量明顯高于未優(yōu)化所表達的蛋白量[16]。因此，在不改變H9N2亞型AIV HA和NA蛋白氨基酸序列的基礎(chǔ)上，本研究對HA和NA基因的密碼子進行了優(yōu)化，使其能在昆蟲細胞中更高效的表達。血凝試驗和Western blot結(jié)果皆證實優(yōu)化的HA和NA基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達成功，并分泌于上清中。而未優(yōu)化密碼子的HA和NA基因無法在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達?？梢姡瑢⒛康钠蔚拿艽a子優(yōu)化成偏嗜桿狀病毒的密碼子，是目的蛋白在該系統(tǒng)中成功表達的重要因素之一。

圖5 Western blot檢測目的蛋白在Sf9細胞中的表達Fig.5 Western blot detection of the target protein in Sf9 cells

圖6 病毒樣顆粒電鏡圖Fig.6 Electron micrograph of VLP

VLP疫苗以其安全性和抗病毒的有效性成為疫苗研究的熱點，流感病毒VLPs疫苗具有巨大的開發(fā)與應(yīng)用前景。目前國內(nèi)H9N2亞型AIV的VLPs疫苗研制幾乎處于空白狀態(tài)。研究表明，流感病毒顆粒組裝的模型是基質(zhì)蛋白（M1）與細胞膜上的“脂筏”區(qū)域連接，并與HA和NA胞內(nèi)區(qū)相互作用，從而啟動病毒組裝和出芽的過程[17-19]。有學(xué)者指出流感病毒的HA和NA在流感VLP的合成、出芽和表達過程中是必須的[12]。對于影響流感VLP形成的關(guān)鍵病毒成分一直存在爭議。在本研究中，經(jīng)密碼子優(yōu)化的HA和NA基因所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞72 h后，便能在上清中檢測到血凝，并且經(jīng)電鏡可觀察到VLP。結(jié)果表明，本研究通過桿狀病毒成功表達了H9N2亞型禽流感病毒HA和NA蛋白，且該兩個蛋白可形成VLP，為后續(xù)VLP疫苗的開發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。