陸方菊，彭 斌，3，何松貴，吳振強*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528203；3.江門市泛亞生物工程與健康研究院，廣東 江門 529000）

黃酒是世界上三大釀造酒之一，在中國人民的日常生活中扮演著重要角色。按照用曲和原料，可以將黃酒分為三類：小麥酒（山東省的即墨老酒），麥曲酒（浙江省紹興黃酒）和紅曲酒（主要分布在福建省的紅曲酒）。黃酒中包含多種潛在的生物活性物質（如氨基酸、多肽、寡糖和多糖以及酚類化合物[1-3]）。紅曲酒與其他黃酒最大的不同是在發(fā)酵過程中使用紅曲作為發(fā)酵曲[4]。紅曲含有一系列的次級代謝產物（如紅曲色素、莫納克林和γ-氨基丁酸等），這些產物賦予紅曲酒明亮的紅色、微妙的甜味以及較高的保健功能[5]。

紅曲是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵產品，以大米作為主要原料，接種紅曲霉固態(tài)發(fā)酵得到紫紅色米曲，因其顏色鮮艷也稱為丹曲或者赤曲。紅曲米具有多種生理活性，如降血壓、降血糖、抗氧化、抑菌、抗疲勞、降血脂等，此外紅曲糖化力高、酯化力強、有獨特的曲香，廣泛用于各種黃酒、白酒、醋和醬的釀造。紅曲因其發(fā)酵工藝、地點和季節(jié)的不同會導致所含微生物產生差異，最常見的是烏衣紅曲和古田紅曲。LIU Z B等[6]測定了古田紅曲和烏衣紅曲兩種紅曲微生物的差異，發(fā)現(xiàn)紅曲霉是其主要的微生物，占70%以上，接下來分別是細菌屬和芽孢桿菌屬，其在紅曲酒發(fā)酵的不同階段中所起的作用不同。LU Q Y等[7]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧電離串聯(lián)質譜法（high-performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-tandem mass spectrometer，HPLC-DAD-ESI-MS/MS）對5年陳釀的古越龍山黃酒中的生物活性物質進行了定性和定量分析，測出9種酚類物質，其中有3種酚類物質沒有被報道過，同時發(fā)現(xiàn)，古越龍山黃酒的抗氧化能力比白酒高，但比葡萄酒的總酚含量和抗氧化活性低。胡均亮等[8]測定了本次研究所用的紅曲米中酚類物質及其抗氧化活性，實驗結果表明，自制紅曲米中含有10種酚類物質，紅曲米樣品中，總多酚和總黃酮含量與抗氧化性指標1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和2,2"-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2"-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基清除率表現(xiàn)出顯著的相關性。紅曲酒中多酚的來源主要是釀造原料和釀造用曲。涂璐等[9]研究了糯米和燕麥兩種原料對黃酒總多酚和抗氧化活性的影響，研究發(fā)現(xiàn)燕麥紅曲酒中的總多酚和抗氧化活性比糯米黃酒更高。目前有關紅曲米對紅曲酒多酚和抗氧化活性的影響研究尚不多。課題組前期用單因素和響應面優(yōu)化法優(yōu)化了紅曲酒的釀造條件，并發(fā)現(xiàn)紅曲米添加量為10%時紅曲酒的風味和口感最佳，紅曲米過高會使得紅曲酒曲味過重[10]。該實驗主要探討紅曲米添加量對紅曲多酚類物質的含量和種類的影響，以及紅曲米添加量對紅曲酒抗氧化活性的影響，為紅曲酒多酚來源和成分的研究提供科學依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒大米、中溫糖化酶（252.89±20.38 U）：廣東省九江酒廠提供；紅曲米：實驗室自制；福林酚試劑（分析純）：廣州市齊云生物技術有限公司；沒食子酸、硫氰酸銨（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；Na2CO3（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；亞油酸：Aladdin試劑公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇、甲醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2"-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2"-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）（≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司；二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、過硫酸鉀、維生素C（vitamin C，VC）（分析純）、沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、芥子酸、阿魏酸、2種黃酮（蘆丁、槲皮素）（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸鈉、乙酸、HCl（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；FeCl3（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）（純度≥99%）：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

BS224S型分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；MP502B型電子天平：上海精密實驗器材有限公司；SW-CK-1潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；ZWYD-2402恒溫培養(yǎng)振蕩器（搖床）：智城分析儀器制造有限公司；LRH-150B型生化培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀、2475HPLC紫外檢測器：美國Waters公司；5804R臺式超速大容量離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲酒發(fā)酵工藝流程及操作要點

大米浸泡→滅菌→冷卻至室溫→接種→前酵→后酵→過濾→煎酒→保存→成品

操作要點：

大米浸泡、滅菌、冷卻至室溫：將淘洗干凈的大米用蒸餾水浸泡24 h，用滅菌鍋115℃滅菌20 min，滅菌完畢放置于超凈臺中自然降溫至室溫。

接種：冷卻至室溫的大米按照課題組之前研究[10]的配方接種酵母2‰、料水比為大米∶水=1∶2（g∶mL）、接種7.2‰中溫糖化酶，添加一定量的紅曲米。

前酵：保鮮膜封口，置于30℃的恒溫箱發(fā)酵7 d。

后酵：改變溫度為25℃，繼續(xù)在恒溫箱中發(fā)酵7 d。

過濾、煎酒、保存：將發(fā)酵好的酒液，用4層紗布擠壓過濾，在80℃的恒溫水浴鍋中煎酒15 min左右，待沉降完全后，轉移至無菌儲液瓶并封口，置于低溫條件下（-4℃）保藏。

1.3.2 紅曲米添加量對紅曲酒多酚的影響

分別添加不同量的紅曲米（0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%），并用白米補齊紅曲米添加的減少量，得到五組不同的紅曲酒，研究紅曲酒中多酚和抗氧化活性的變化。

1.3.3 測定方法

總酚含量：采用福林酚試劑方法[11]，以沒食子酸當量表示。取1 mL適當稀釋的紅曲酒液，加入0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻后，反應3～8min，加入1.5mL 200mg/LNa2CO3溶液，搖勻，加蒸餾水定容至10 mL，室溫條件下放置反應60 min，于波長765 nm處測定吸光度值。

總抗氧化能力的測定：采用硫氰酸鹽法測定酒樣對亞油酸體系總抗氧化作用[12]。

DPPH自由基清除能力：采用參考文獻[13]的方法，稍作調整。反應體系包括400μL的DPPH甲醇溶液（100μmol/L）和50 μL稀釋到合適倍數(shù)的酒樣。將混合液置于旋轉渦旋儀上混勻，黑暗環(huán)境中，25℃反應30 min。用酶標儀測定其在波長517 nm處的吸光度值，平行測定3次。酒樣DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為未加樣品時DPPH溶液在波長517 nm處的吸光度值；A1為DPPH溶液和酒樣反應后在波長517 nm處吸光度值。

ABTS+自由基清除能力：采用參考文獻[14]的方法，稍作調整。等體積混合過硫酸鉀（2.45 mmol/L）氧化ABTS（7 mmol/L），在25℃條件下，黑暗環(huán)境中反應16 h，制備新鮮的ABTS+自由基溶液。將新鮮制備的ABTS+溶液用乙醇稀釋至吸光度值為0.70±0.02（波長734 nm處）待用。ABTS+自由基清除測試反應體系包含100 μL稀釋適當倍數(shù)的酒樣與400 μL ABTS+稀釋液，將混合液置于旋轉渦旋儀上混勻，置于黑暗環(huán)境，25℃反應10 min。用酶標儀測定混合液在波長734 nm處的吸光度值。酒樣ABTS+自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為未加樣品時ABTS+溶液在波長734 nm處的吸光度值；A1為ABTS+溶液和樣品的反應后在波長734 nm處的吸光度值。

式中：a、b分別為VC ABTS+（DPPH）自由基清除率標準曲線的斜率和截距；K為對應酒樣的稀釋倍數(shù)。

鐵還原/抗氧化能力（ferricionreducingantioxidantpower，F(xiàn)RAP）測定：采用參考文獻[15]的方法，稍作調整。FRAP反應體系包括3 mL FRAP試劑與100 μL稀釋合適倍數(shù)的酒樣，將反應液置于旋轉渦旋儀上混勻，在室溫條件下孵育30min后，測定其在波長593 nm處的吸光度值。用1g/L的BHT作為陽性對照，進行FRAP試驗。樣品的鐵離子還原氧化力用每1 L相當于VC的摩爾數(shù)表示。所有樣品測試均執(zhí)行3次。

多酚測定：采用參考文獻[16]的方法，稍作調整。采用高效液相色譜（HPLC）法分析，二極官陣列檢測器（DAD）檢測酒樣中的多酚組成，紅曲酒樣品用0.22 μm有機濾膜過濾。HPLC色譜系統(tǒng)包括Waters e2695分離系統(tǒng)和Waters2998 PDA檢測系統(tǒng)；色譜柱為Sunfire C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱溫30 ℃；樣品進樣體積10 μL；流動相分A相和B相，A相為磷酸緩沖液（pH=2.5），B相為乙腈；洗脫流速0.8 mL/min，采取梯度洗脫（0～35 min，15%B；35～36 min，50%B；36～40min，80%B；40～45min，20%B；45～55 min，15%A），洗脫時間55 min；二極管陣列檢測器（DAD）檢測波長200～600 nm，記錄多酚光譜，提取色譜圖波長280 nm。通過對比標準品的HPLC保留時間和紫外光譜，對多酚提取液的組成成分進行初步分析鑒定。

2 結果與分析

2.1 紅曲米添加量對紅曲酒總酚含量的影響

圖1 不同紅曲米添加量對紅曲酒總酚含量的影響Fig.1 Effect of different Hongqu rice addition on total phenolic content of Hongqu rice wine

由圖1可知，紅曲米添加量為0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%時，紅曲酒的總酚含量分別為87.19 mg/L、313.28 mg/L、368.51 mg/L、423.74 mg/L、470.07 mg/L，紅曲米添加量越大，紅曲酒的總酚含量越高，紅曲米添加量為10%和7.5%的紅曲酒總酚含量差異明顯（P＜0.01），表明紅曲米的添加量對紅曲酒總酚含量影響很大。紅曲酒總酚含量增加將有助于提升其健康價值，總酚含量與抗氧化性具有很大的相關性[17]，酚類物質具有清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）[18-20]、抑制油系統(tǒng)氧化[21]、抑制人體低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）氧化[22-23]、降低人體患心血管疾病的能力[24-26]。紅曲酒中總酚含量越高，說明抑制油脂過氧化和降低人體患心血管、癌癥等疾病的能力越強，保健功效越好。因此選擇紅曲米添加量10%為宜。

2.2 紅曲米添加量對紅曲酒多酚成分的影響

酚酸和類黃酮存在于谷物中的形式有游離和共軛兩種，如水稻中主要酚類物質阿魏酸和對-香豆酸是以游離、可溶和不可溶等形式存在[27]。在釀酒過程，原料大米中原來不可溶的多酚類物質，由于微生物生命活動，發(fā)生酶作用而不斷的釋放，使酒體中可溶性多酚含量升高。用HPLC定性并定量分析不同紅曲米添加量對紅曲酒5種酚酸、2種黃酮成分的影響，結果如表1所示。

表1 不同紅曲米添加量對紅曲酒多酚化合物含量的影響Table 1 Effect of different Hongqu rice addition on polyphenolic compounds content of Hongqu rice wine mg/L

由表1可知，隨著紅曲米添加量的增加，沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、芥子酸、阿魏酸和蘆丁也隨之增加，與總酚含量的增加趨勢一致。添加量為10.0%時含量分別為5.54 mg/L、11.33 mg/L、3.18 mg/L、9.14 mg/L、12.42 mg/L和4.46 mg/L，分別是未接種時的1.83、4.21、2.05、6.01、8.12和2.34倍。而槲皮素只有在紅曲米添加量為5.0%時才能檢測出。說明隨著紅曲米添加量的增加，紅曲酒中的單體多酚種類和含量也有所增加，提高了紅曲酒的抗氧化活性。

2.3 紅曲米添加量對紅曲酒總抗氧化能力的影響

脂質過氧化是由多種自由基作用引發(fā)的現(xiàn)象，因此亞油酸脂質過氧化體系常用作為評價樣品的總抗氧化能力[28]，樣品的抗亞油酸過氧化抑制率越高表明樣品的總抗氧化能力越強。不同紅曲米添加量對紅曲酒總抗氧化能力的影響見圖2。

圖2 不同紅曲米添加量對紅曲酒的總抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of different Hongqu rice addition on total antioxidant activity of Hongqu rice wine

由圖2可知，紅曲酒劑量為200 μL時，紅曲米添加量為10.0%、7.5%、5.0%、2.5%、0和陽性對照BHT（1 g/L）的抑制率分別是70.2%、49.3%、39.0%、35.0%、28.3%和91.7%，即除了陽性對照BHT外，紅曲米添加量10%的抑制率相對于其他酒樣的抑制率最高，是不添加紅曲米的2.48倍。不添加紅曲米時抑制率較其他樣品都低，說明提高紅曲米添加量，可提高紅曲酒的總抗氧化能力。但總體來說，5種紅曲酒的脂質過氧化抑制效果都不如BHT。

2.4 不同紅曲米添加量對紅曲酒的抗氧化活性影響

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除實驗是備受歡迎的評價樣品的體外抗氧化能力的基礎實驗[29-31]。不同紅曲米添加量對紅曲酒DPPH自由基清除能力的影響見圖3。

由圖3可知，隨著紅曲米添加量的增加，各酒樣的DPPH自由基清除能力也相應增加，當紅曲米添加量為10.0%時，紅曲酒的DPPH自由基清除能力達到最大，為129.20mg VC/L，是不添加紅曲米的3.36倍，與前面測定的總酚含量以及總抗氧化能力測定的結果相一致，說明提高紅曲米的添加量可提高酒樣中的總酚含量，從而提高其抗氧化活性。

圖3 不同紅曲米添加量對紅曲酒DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of different Hongqu rice addition on DPPH free radical scavenging capacity of Hongqu rice wine

半抑制量（50%inhibiting concentration，IC50）值被廣泛用于進一步評價樣品抗氧化能力強弱的指標，其值越小，樣品的抗氧化能力越強。本實驗測定了不同酒樣DPPH清除能力的IC50值，結果如圖4所示。

圖4 不同紅曲米添加量對紅曲酒的DPPH自由基半抑制量（IC50值）的影響Fig.4 Effect of different Hongqu rice addition on IC 50 value of DPPH free radical of Hongqu rice wine

由圖4可知，不添加紅曲米的紅曲酒IC50值明顯高于其他酒樣，為557.30 μL，是紅曲米添加量10.0%的8.95倍。酒樣IC50值的結果與總酚、總抗氧化能力以及DPPH自由基清除能力的測定結果規(guī)律一致，說明提高紅曲米的添加有利于紅曲酒抗氧化活性的提高。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力是抗氧化劑另一種體外抗氧化能力常用的測定方法，相比于醇溶性的DPPH，ABTS試劑既具有水溶性又具有醇溶性，即能和親脂性和親水性的抗氧化劑快速反應[32]。不同紅曲米添加量對紅曲酒ABTS+自由基清除能力的影響如圖5所示。

由圖5可知，紅曲酒的ABTS+自由基清除能力隨著紅曲米添加量的增加而上升，與DPPH自由基清除率趨勢一致。紅曲米添加量為10.0%時的紅曲酒ABTS+自由基清除率最大，為367.66mg VC/L，是不添加紅曲米的7.82倍。說明紅曲米的添加量增加，提高了紅曲酒的自由基清除活性。

圖5 不同紅曲米添加量對紅曲酒ABTS+自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of different Hongqu rice addition on ABTS+free radical scavenging capacity of Hongqu rice wine

2.4.3 還原力FRAP值

FRAP值是測定分析樣品將鐵（Fe3+）還原成亞鐵（Fe2+）狀態(tài)方面的抗氧化能力[33]，不同紅曲米添加量對紅曲酒的FRAP值影響如圖6所示。由圖6可知，隨著紅曲米添加量的增加，紅曲酒的FRAP值也在增加，說明提高紅曲米添加量有助于提升紅曲酒的還原力。紅曲米添加量為10%的紅曲酒還原力最高，可達到1 574.54 μmol/L，是不添加紅曲米的2.35倍。但低于食品加工常用的抗氧化劑BHT（1 g/L）的FRAP值（2 391.94 μmol/L）。

圖6 不同紅曲米添加量對紅曲酒的FRAP值的影響Fig.6 Effect of different Hongqu rice addition on FRAP value of Hongqu rice wine

2.5 酚類化合物和抗氧化活性的相關性分析

為探究紅曲酒中主要的多酚化合物的抗氧化活性，對多酚化合物含量與抗氧化活性進行了相關性矩陣分析，結果如表2所示。

由表2可知，紅曲酒中主要的酚類物質含量均與總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基能力和還原力（FRAP）相關。總抗氧化能力與綠原酸含量高度相關（R=0.995，P＜0.01），而與對羥基苯甲酸、蘆丁、芥子酸、阿魏酸的含量具有較高的相關性（R＞0.920，P＜0.05），與沒食子酸和槲皮素的含量相關性不高。DPPH和ABTS+自由基清除能力與蘆丁、芥子酸和阿魏酸的含量具有較高的相關性（R＞0.896，P＜0.05），而且ABTS+自由基清除能力還與槲皮素含量具有較高的相關性（R=0.936，P＜0.05）。還原力與蘆丁、芥子酸和槲皮素含量高度相關（R＞0.960，P＜0.01），與綠原酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸的含量具有較高的相關性（R＞0.890，P＜0.05）?？傊孀铀?、阿魏酸、蘆丁這三種酚類物質的含量與紅曲酒的總抗氧化能力、DPPH和ABTS+自由基清除能力以及還原力都有較高的相關性（R＞0.890，P＜0.05）。

表2 紅曲酒酚類化合物和抗氧化活性的相關性分析Table 2 Correlation analysis of phenolic compounds and antioxidant activities of Hongqu rice wine

3 結論

各酒樣總酚含量隨紅曲米添加量的增加而增加，說明紅曲米是紅曲酒中多酚類物質的重要來源，而且總酚測定的結果與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和FRAP法測定酒樣的還原力結果相吻合，均隨著紅曲米添加量的增加而增加。紅曲酒的單體酚酸種類和含量隨著紅曲米添加量的增加有所提升，沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、芥子酸、阿魏酸和蘆丁在紅曲米添加量為10%時的含量分別達到5.54 mg/L、11.33 mg/L、3.18 mg/L、9.14 mg/L、12.42 mg/L和4.46 mg/L，而槲皮素只有在紅曲米添加量增加到一定程度的紅曲酒中才能檢測出。芥子酸、阿魏酸、蘆丁這三種酚類物質與紅曲酒的總抗氧化能力、DPPH和ABTS+自由基清除能力以及還原力都有較高的相關性（R＞0.890，P＜0.05）。本結果為深入研究紅曲酒多酚的來源和抗氧化活性的提高提供了參考和數(shù)據(jù)支持。