葉文斌 何玉鵬 文曉曉 尤旦娃 趙 麗 楊 滟

(1. 隴南師范高等專(zhuān)科學(xué)校，農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500； 2. 隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開(kāi)發(fā)中心，甘肅 成縣 742500； 3. 甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 天水 741000)

0 引 言

鉛是有毒重金屬，也是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，污染范圍己由職業(yè)環(huán)境擴(kuò)大到生活環(huán)境，對(duì)人體健康造成較大危害[1]，近年來(lái)大量研究表明，慢性鉛中毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、肝、腎、脾等全身各系統(tǒng)和器官均有毒性作用，導(dǎo)致如心肌炎、心臟傳導(dǎo)功能障礙、改變心肌細(xì)胞膜通透性等疾病也越來(lái)越多[2-3]．鉛對(duì)動(dòng)物及人群毒理作用常表現(xiàn)為減少精液量，降低精子活力和密度，增加畸形率[4]，血清中睪酮黃體生成素、卵泡刺激素和雌二醇水平波動(dòng)較大，使內(nèi)分泌功能紊亂[5-7]，刺激月經(jīng)周期和經(jīng)期異常，引起不良妊娠和子代生長(zhǎng)發(fā)育缺陷[8-9]；鉛還能聚積在細(xì)胞核內(nèi)，干擾細(xì)胞增殖和DNA的合成，影響DNA復(fù)制的精確性而導(dǎo)致染色體丟失[10]．果蠅具有生存期短、繁殖量大、飼養(yǎng)簡(jiǎn)便和反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，因其代謝系統(tǒng)、生理功能、性別決定和生長(zhǎng)發(fā)育等方面同哺乳動(dòng)物基本相似，故較多地將其應(yīng)用于衰老或壽命等方面的研究[11-12]，同時(shí)果蠅是真核生物，具有與人類(lèi)相似的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、衰老等階段．果蠅的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，在藥物和功能食品研究中，果蠅常用作延緩衰老實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，特別是在遺傳生物學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法中應(yīng)用較多[13]．

動(dòng)物體內(nèi)鉛的積累會(huì)影響其正常生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及衰老，甚至?xí)l(fā)生病變和死亡．因此，本文以模式動(dòng)物黑腹果蠅(drosophilamelanogaste)為研究對(duì)象，采用生存實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析方法研究不同濃度鉛處理對(duì)果蠅的毒理作用，分析探討鉛對(duì)果蠅壽命和生育力及抗氧化能力的影響，以期為環(huán)境中重金屬元素鉛對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究提供證據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

恒溫生化培養(yǎng)箱 (寧波東南儀有限公司).高溫滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司).超凈工作臺(tái)(山東博客科學(xué)儀器有限公司).電子天平(福州華志科學(xué)有限公司).組織勻漿器(上海壘固儀器有限公司).L5紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司).高速冷凍離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司).電爐(上海圣科儀器設(shè)備有限公司).超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)20160822)、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號(hào)20170509)、MDA試劑盒(批號(hào)20170729)均由南京建成生物工程研究所提供．乙醚、乙醇、丙酸、硝酸鉛均為分析純(西安天茂化工有限公司).蔗糖、瓊脂、酵母膏[卡邁舒(上海)生物科技有限].玉米粉(購(gòu)自隴南成縣五洲超市).

1.2 研究對(duì)象

野生型黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)由西北師范大學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)于溫度為25℃，相對(duì)濕度為65%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

基本培養(yǎng)基用250 mL蒸餾水，28 g玉米粉，22 g 蔗糖，2.5 g瓊脂，2 mL丙酸和2.5 g鮮酵母加熱配制[11]．在基本培養(yǎng)基中加入Pb(NO3)2溶液，濃度分別為1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4和1.0×10-5g/mL，設(shè)基本培養(yǎng)基為對(duì)照組．

1.3.1生育力測(cè)定

在無(wú)菌狀態(tài)下，每瓶各接種10對(duì)未交配的雄果蠅和處女蠅放入上述培養(yǎng)基中，7 d后移去親本，待出現(xiàn)子一代(F1)果蠅時(shí)，按性別分別統(tǒng)計(jì)數(shù)量和性別比，在觀(guān)察記載的同時(shí)，隨機(jī)取出10對(duì)未交配的F1代雌、雄果蠅重新放入新培養(yǎng)基中作繼代培養(yǎng)，繁殖子二代(F2)，F(xiàn)2代再繼代培養(yǎng)至子三代(F3)，F(xiàn)3代再繼代培養(yǎng)至子四代(F4)，每處理設(shè)10個(gè)重復(fù)，分別統(tǒng)計(jì)其數(shù)量和性別比[11]．

表1 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅世代生育力統(tǒng)計(jì)只)

注：a與0濃度組相比，t=0.006 5～0.008 1，P<0.01

1.3.2壽命測(cè)定

收集未交配的雌、雄果蠅隔離培養(yǎng)，每瓶各接入50只，兩種培養(yǎng)基各接10瓶(5♀，5♂)，每天觀(guān)察，記錄死亡個(gè)體數(shù)，直到最后一只果蠅死亡[11]．對(duì)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果進(jìn)行整理，計(jì)算出平均壽命和最高壽命，平均壽命=每組所有果蠅壽命之和÷果蠅總數(shù)；最高壽命=每組最后4只果蠅生存時(shí)間的總和÷4；從生育力實(shí)驗(yàn)中取F2至F4代進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)，方法同前，以比較其與前者死亡率的差異．

1.3.3果蠅抗氧化活性測(cè)定

將培養(yǎng)30 d的果蠅50只，移入含有濕潤(rùn)濾紙的空白管中，用乙醚使其麻醉、稱(chēng)重后放入4 ℃預(yù)冷的研缽中，按49 ∶1(μL/mg)的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，充分研磨后，經(jīng)冷凍離心機(jī)3 500 轉(zhuǎn)/min離心15 min，離心半徑3cm，取上清液進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定．超氧化物歧化酶(SOD)活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量及測(cè)試液中蛋白質(zhì)含量均采用對(duì)應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定．所需試劑均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制，測(cè)定方法嚴(yán)格遵循試劑說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行．

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié) 果

2.1 Pb2+對(duì)果蠅生育力的影響

不同濃度Pb2+對(duì)果蠅世代生育力、世代生育總量和性別比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表1～3．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅數(shù)量均呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)．在Pb2+濃度為1×10-5g/mL時(shí)，雌、雄果蠅數(shù)量和果蠅世代總量均低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.006 5，P<0.01)；當(dāng)Pb2+濃度為1×10-2g/mL時(shí)，雌、雄果蠅數(shù)量和果蠅世代總量是對(duì)照的50%左右；在Pb2+濃度為1×10-5和1×10-4g/mL時(shí)，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值變化不大，總體接近于1 ∶1；Pb2+濃度為1×10-3g/mL時(shí)，F(xiàn)1至F4代雌、 雄果蠅數(shù)量的比值發(fā)生了明顯的變化，F(xiàn)1至F2代雌、雄果蠅數(shù)量的比值變化不大，總體接近于1 ∶1，F(xiàn)3至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值為1.116 ∶1和1.143 ∶1；隨著Pb2+濃度升高為1×10-2g/mL時(shí)，F(xiàn)3至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值為1.316 ∶1 和1.165 ∶1，果蠅世代總量雌、雄果性別比為1.115 ∶1，結(jié)果表明Pb2+對(duì)果蠅生育力的影響雄性大于雌性．

表2 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅世代生育總量統(tǒng)計(jì)只)

注：a與0濃度組相比，t=0.007 1～0.008 9，P<0.01

表3 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅世代性別比統(tǒng)計(jì)結(jié)果(♀ ∶♂)

表4 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅不同世代壽命統(tǒng)計(jì)

注：a與0濃度組相比，t=0.006 7～0.008 4，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.038 2～0.045 3，P<0.05

表5 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅累積世代壽命統(tǒng)計(jì)

注：a與0濃度組相比，t=0.004 9～0.009 0，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.036 7～0.048 4，P<0.05

2.2 Pb2+對(duì)果蠅壽命的影響

不同濃度Pb2+對(duì)果蠅世代壽命和累積世代壽命的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表4和表5．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅的壽命均呈出降低的趨勢(shì)．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-2g/mL時(shí)，與其他組相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅的壽命，雌、雄果蠅的總壽命和雌、雄果蠅的最長(zhǎng)壽命都最低，雌、雄果蠅的壽命分別為(41.92±0.16)和(36.88±0.35)d，對(duì)照組的壽命分別為(59.59±0.58)和(58.68±0.51)d；雌、雄果蠅的最長(zhǎng)壽命分別為(56.68±0.41)和(57.61±0.25)d，對(duì)照組的最長(zhǎng)壽命分別為(84.39±0.69)和(83.25±0.75)d．Pb2+濃度在1.0×10-3～1.0×10-5g/mL時(shí)，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅的壽命逐漸升高．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-5g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅壽命，雌、雄果蠅的總壽命和雌、雄果蠅的最長(zhǎng)壽命都最高，但仍低于對(duì)照，與對(duì)照組相比存在顯著性差異(t=0.008 4，P< 0.01)．

表6 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅超氧化物歧化酶活性的影響結(jié)果

注：a與0濃度組相比，t=0.005 2～0.009 2，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.034 1～0.047 6，P<0.05

表7 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅過(guò)氧化物酶活性的影響結(jié)果

注：a與0濃度組相比，t=0.006 4～0.008 6，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.046 5～0.048 9，P<0.05

表8 不同濃度Pb2+對(duì)果蠅丙二醛含量的影響結(jié)果

注：a與0濃度組相比，t=0.005 6～0.007 7，P<0.01；b與0濃度組相比，t=0.041 7～0.047 3，P<0.05

2.3 Pb2+對(duì)果蠅抗氧化酶的影響

不同濃度Pb2+對(duì)雌、雄果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性和MDA含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表6～8．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-2g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性都最低，與對(duì)照相比存在極顯著差異(t=0.009 2，P<0.01)．當(dāng)Pb2+濃度在1.0×10-5～1.0×10-3g/mL時(shí)F1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的SOD和CAT活性逐漸升高．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-5g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的SOD和CAT活性都最高，但仍極顯著高于對(duì)照(t=0.005 2，P<0.01)．隨著Pb2+濃度的升高，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量均呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，與果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性呈相反趨勢(shì)．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-2g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)MDA含量是最高的，與其他濃度相比存在極顯著的差異(t=0.007 3，P<0.01)．當(dāng)Pb2+濃度為1.0×10-5g/mL時(shí)，與其他濃度相比，F(xiàn)1至F4代雌、雄果蠅體內(nèi)的MDA含量都是最低的，與對(duì)照組相比存在極顯著的差異(t=0.006 8，P<0.01)，這也說(shuō)明，隨著Pb2+濃度的降低，Pb2+對(duì)果蠅的毒害作用在逐漸減弱，果蠅的抗氧化作用也在逐漸增強(qiáng)．在不同Pb2+濃度處理下雌性果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性和MDA含量均低于雄性果蠅體內(nèi)的含量，這也說(shuō)明，雄性果蠅的抗氧化作用強(qiáng)于雄性果蠅．

3 討 論

鉛是一種用途廣泛的重金屬，可經(jīng)呼吸道、消化道等不同途徑進(jìn)入人體并產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性，可影響大腦皮層興奮與抑制的平衡，以及對(duì)周?chē)窠?jīng)產(chǎn)生直接損傷，也會(huì)與巰基蛋白結(jié)合并抑制酶的活力和氧化磷酸化，干擾人體的正常代謝，同時(shí)還會(huì)損害小動(dòng)脈和毛細(xì)血管，導(dǎo)致血管痙攣，將明顯增加心血管疾病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[14-16]．果蠅因?yàn)榫哂猩嫫诙?、繁殖快、反?yīng)靈敏、培養(yǎng)和管理方便，且代謝途徑、生理功能和發(fā)育階段同哺乳動(dòng)物基本類(lèi)似等特性常被用作動(dòng)物模型來(lái)研究抗衰老活性及動(dòng)物抗衰老機(jī)制[17]．本研究以果蠅為研究對(duì)象，探討了不同濃度的Pb2+對(duì)果蠅生育力和壽命的影響，并以抗氧化酶活性SOD和CAT活以及脂質(zhì)過(guò)氧化酶產(chǎn)物MDA含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)了的抗氧化活性．結(jié)果表明，添加不同Pb2+濃度使F1至F4代雌、雄果蠅世代生育力減弱，壽命降低，當(dāng)Pb2+濃度達(dá)1.0×10-2g/mL時(shí)效果最為明顯，這時(shí)果蠅體內(nèi)MDA含量大量積累，SOD和CAT活性急劇降低，使果蠅提前衰老、死亡并且降低或喪失生殖能力，F(xiàn)3和F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值為1 ∶1.316和1 ∶1.165，果蠅世代總量雌、雄果性別比為1 ∶1.113，這種結(jié)果表明Pb2+對(duì)果蠅生育力的影響雄性大于雌性． 而在Pb2+濃度較低時(shí)(1.0×10-5g/mL)F1至F4代雌、雄果蠅數(shù)量的比值變化不大，總體接近于1 ∶1．

果蠅的衰老與體內(nèi)自由基的水平、抗氧化能力及甲基化水平密切相關(guān)，過(guò)多的自由基與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，可破壞DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生甚至死亡[18]．鉛是一種全身性毒物，機(jī)體不同系統(tǒng)和器官對(duì)鉛的毒性效應(yīng)的敏感性不同，血液中鉛質(zhì)量濃度超過(guò)100 μg/L 時(shí)，即可人體智力發(fā)育造成嚴(yán)重影響[19]，5×105μg/L鉛水平可導(dǎo)致大鼠海馬細(xì)胞凋亡[20]，Southard等[21]研究發(fā)現(xiàn)，血鉛質(zhì)量濃度>331 μg/L 時(shí)人體發(fā)生腎細(xì)胞癌的危險(xiǎn)性增加．所以當(dāng)重金屬鉛的存在時(shí)，對(duì)果蠅體內(nèi)SOD、CAT活力以及MDA含量產(chǎn)生了較為明顯的影響，這種脅迫結(jié)果已經(jīng)表明Pb2+與果蠅的衰老之間存在特定的關(guān)系，MDA是在高濃度Pb2+處理下，果蠅體內(nèi)細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸受自由基作用產(chǎn)生的過(guò)氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，當(dāng)與蛋白質(zhì)、肽類(lèi)等大分子聚合后會(huì)引起機(jī)體的衰老[1-3]，從而影響果蠅的壽命．SOD和CAT都具有一定的抗氧化活性，能夠清除生物體內(nèi)自由基并通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程而延緩衰老，當(dāng)Pb2+濃度較高時(shí)，MDA含量急劇升高，SOD和CAT的抗氧化活性降到了最低，可能是，大量積累的MDA刺激果蠅主動(dòng)啟動(dòng)SOD和CAT清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基而消耗了兩者的量，來(lái)主動(dòng)增強(qiáng)果蠅的抗性，同時(shí)間接促進(jìn)生育能力．影響果蠅的生育力的因素是多方面的，也是一個(gè)非常復(fù)雜的研究課題，而Pb2+是如何在分子水平參與生殖破壞的，還需進(jìn)一步研究與探索．