倪慧，李華佳，李可，尚雪嬌，朱永清，郭壯，*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川 成都 610066）

獼猴桃又稱奇異果，因其口感酸甜，富含豐富的VE、VC、膳食纖維、黃酮和多酚等營養(yǎng)成分[1-2]，且具有降血脂[3]和抗氧化[4]功能而深受消費者的喜愛。獼猴桃屬于呼吸躍變型水果，采摘后容易軟化和腐敗變質(zhì)[5]，因而對獼猴桃進行深加工則顯得尤為重要。發(fā)酵制作獼猴桃酒不僅可以提高獼猴桃的利用率[6-7]，而且能更好發(fā)揮其特有的保健功效[8]，同時提高農(nóng)產(chǎn)品附加值。作為影響獼猴桃酒風味形成的重要影響因素之一[9]，通過測定有機酸種類和含量可間接對獼猴桃酒品質(zhì)的優(yōu)劣進行評價。

目前常采用酸堿滴定法[10]、離子色譜法[11]、紅外光譜法[12]和色譜法[13]對食品中有機酸的種類和含量進行測定。GB5009.157-2016《食品安全國家標準食品中有機酸的測定》中約束了使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 測定食品中的有機酸，相較于其他方法，該方法具有準確、方便和快捷等優(yōu)點。雖然可以參照GB2758-2012《食品安全國家標準發(fā)酵酒及其配制酒》采用HPLC 法測定獼猴桃酒中的有機酸，但上述標準對獼猴桃和獼猴桃酒中的特征酸——奎寧酸[14]的檢測方法并未加以描述，因此對獼猴桃酒中有機酸的測定方法進行優(yōu)化則顯得尤為重要。

本試驗采用HPLC 對獼猴桃酒中奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的測定方法進行了優(yōu)化，并對10 個自釀獼猴桃酒中4 種有機酸的含量進行了測定。通過本項目的開展，實現(xiàn)了獼猴桃酒中4 種有機酸的快速檢測和定量分析，以期為后續(xù)獼猴桃酒的生產(chǎn)工藝改良和相關標準的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lactobacillus plantarum（植物乳桿菌）：由湖北文理學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌種資源庫提供；獼猴桃酒：湖北文理學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自釀；奎寧酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸：均為標準品，默克生命科學（上海）有限公司；磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、磷酸：均為分析純，西隴科學股份有限公司；甲醇、乙腈、異丙醇：均為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀、果膠酶（5 萬U/g）：均為食品級，煙臺帝伯仕自釀機有限公司；0.22 μm 一次性針頭式過濾器和合成纖維樹脂濾膜：上海市新亞凈化器件廠。

LC-20ADXR 高效液相色譜儀（配置有LC-20AD XR 四元低壓梯度泵、SIL-20A XR 自動進樣器、CTO-10AS vp 柱溫箱和SPD-M20A 二極管陣列檢測器）、InertSustainSwift C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：日本島津公司；5810R 臺式高速冷凍離心機：德國Ep－pendorf 公司；PHS-25 型pH 計：上海儀電科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件的優(yōu)化

1.2.1.1 有機酸標準溶液配制

準確稱取0.600 0 g 奎寧酸、0.600 0 g 蘋果酸、3.000 0 g 乳酸和1.200 0 g 檸檬酸標準品，溶解后于50 mL 容量瓶中定容，配制成不同濃度的有機酸母液待用。

1.2.1.2 供試溶液的配制

吸取各有機酸母液0.50 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.20 mL 的0.10 mol/L 磷酸溶液后定容，制成混合有機酸的標準供試溶液，取上清液過0.22 μm 針孔濾膜后直接進樣。

1.2.1.3 磷酸鹽種類的選擇

分別配制溶度為0.08 mol/L 的磷酸氫二銨溶液和磷酸二氫鉀流動相，pH 值為2.90，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.4 磷酸鹽濃度的選擇

分別配制溶度為 0.01、0.05、0.08 mol/L 的磷酸二氫鉀流動相，pH 值為 2.90，進樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.5 pH 值的選擇

配制溶度為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀流動相，調(diào)節(jié)pH 值分別為 2.90、2.50 和 2.30，進樣量為 20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.6 有機相的選擇

分別設置乙腈和水相的體積比為 0 ∶100、5 ∶95 和10 ∶90，流動相為 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，pH 值為2.90，進樣量為 20 μL，柱溫為 30 ℃，流速為 1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.1.7 流速的選擇

分別設置流速為 0.05、0.80、1.00 、1.20 mL/min，流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 值為2.90，進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為215 nm。

1.2.1.8 柱溫的選擇

分別設置柱溫為25、30、35 ℃，流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH 值為2.90，進樣量為20 μL，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.2 獼猴桃酒中4 種有機酸的測定

1.2.2.1 獼猴桃酒的制作

稱取成熟獼猴桃洗凈打漿，添加4 g 的偏重亞硫酸鉀和0.06%的果膠酶攪拌均勻后調(diào)節(jié)糖度為22°Brix，接種60 g 釀酒酵母6 h 后分裝并按107CFU/mL 獼猴桃酒添加量分別接入10株植物乳桿菌，于22 ℃發(fā)酵7 d，再18 ℃進行后發(fā)酵20 d 后待用，其編號為GJ1～GJ10。

1.2.2.2 標準曲線的制備

分別吸取 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL 不同母液于10 mL 容量瓶，加0.20 mL 的0.10 mol/L 磷酸溶液后定容，配制出不同梯度標準品溶液，溶液過0.22 μm 的針孔濾膜待用。分別以4 種有機酸的濃度為自變量x，峰面積為因變量y，采用外標法進行計算。

色譜條件：流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH值為2.90；進樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，檢測波長為215 nm。

1.2.2.3 獼猴桃酒中4種有機酸含量的測定

吸取2.0 mL 獼猴桃酒于10 mL 容量瓶中，加入0.20 mL 的 0.10 mol/L 磷酸溶液，用 0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液定容。混合均勻后轉(zhuǎn)移至離心管中10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm 針孔濾膜后直接進樣，按照1.2.2.2 的色譜條件進行4 種有機酸含量的測定。

1.2.3 方法性能研究

1.2.3.1 精密性試驗

將1.2.1.2 中的供試樣品溶液連續(xù)進樣7 次，分別對檸檬酸、蘋果酸、乳酸和奎寧酸的峰面積進行測定，然后計算其相對標準偏差值（relative standard deviation，RSD）。色譜條件同 1.2.2.2。

1.2.3.2 重復性試驗

取GJ1 樣品2 mL 于10 mL 容量瓶中，并加入0.20 mL 的0.01 mol/L 磷酸溶液，用0.01 mol/L 磷酸二氫鉀定容?；旌暇鶆蚝筠D(zhuǎn)移至離心管中10 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm 針孔濾膜待用。按照1.2.2.2 的色譜條件對其峰面積進行測定，試驗重復操作7 次。

1.2.3.3 加標回收率試驗

取1.2.3.2 中濾液4 份，分別編號為GJ11、GJ12、GJ13 和 GJ14，其中 GJ11 不做任何處理，GJ12、GJ13 和GJ14 分別加入不同濃度標準品混合溶液，色譜條件同1.2.2.2。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution 軟件將色譜圖另存為數(shù)據(jù)矩陣后，使用Origin 8.5 軟件（O－riginLab，MA，ΜSA）作圖。使用高效液相色譜工作站自帶的LCsolution 軟件對4 種有機酸進行定性和定量分析。采用保留時間對有機酸種類進行定性，采用外標法對有機酸進行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 磷酸鹽的選擇

磷酸二氫鉀和磷酸氫二銨對4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖1所示。

圖1 流動相磷酸鹽種類對4 種有機酸分離效果的影響Fig.1 Effects of phosphate type of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖1 可知，當選擇磷酸鹽作為流動相時，4 種有機酸都能得到較好的分離，且當選擇磷酸氫二銨時，各有機酸的保留時間相較于磷酸二氫鉀小，檢測時間更短。但對比兩圖可知，以磷酸氫二銨作為流動相時，奎寧酸、乳酸和檸檬酸的峰形相較之磷酸二氫鉀差，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，本研究選擇使用磷酸二氫鉀作為流動相。

2.1.2 流動相中磷酸鹽濃度的選擇

濃度為 0.01、0.05、0.08 mol/L 磷酸二氫鉀對 4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖2所示。

圖2 流動相磷酸二氫鉀濃度對4 種有機酸分離效果的影響Fig.2 Effects of monopotassium phosphate concentration in mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖2 可知，磷酸二氫鉀的濃度對于4 種有機酸的保留時間和峰形均具有一定的影響，對比3 個不同磷酸二氫鉀濃度的色譜圖可知，隨著磷酸二氫鉀濃度的降低4 種有機酸的保留時間也相應的縮短，從而縮短單次分析的時間。同時，觀察3 號和4 號峰可知，隨著磷酸二氫鉀濃度的升高，3 號和4 號峰的峰形也越差，且當磷酸二氫鉀的濃度為0.08 mol/L 時，基線出現(xiàn)下偏。因此，本研究選擇0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀溶液作為流動相。

2.1.3 流動相pH 值的選擇

pH 值為 2.30、2.50 和 2.90 的磷酸二氫鉀流動相對4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖3所示。

圖3 流動相pH 值對4 種有機酸分離效果的影響Fig.3 Effect of pH of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖3 可知，流動相的pH 值對4 種有機酸的保留時間和峰形均存在較大的影響，對比不同pH 值的色譜圖可知，隨著pH 值的上升4 種有機酸的保留時間均有較大的縮短，特別是檸檬酸的保留時間由7.20 min縮短至5.90 min。由圖3 亦可知，當pH 值為2.30 時，基線并不穩(wěn)定，而有向上漂移的趨勢；當pH 值為2.50時，3 號峰和4 號峰的分離度過大，保留時間相對較長，且對比 3 個圖發(fā)現(xiàn)，pH 值為 2.30 和 2.50 時，均出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象。因此，本研究選擇磷酸鹽溶液的pH 值為2.90。

2.1.4 流動相中有機相比例的選擇

調(diào)節(jié)乙腈和磷酸鹽溶液的體積比分別為0 ∶100、5 ∶95 和 10 ∶90，研究其對 4 種有機酸保留時間及分離效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 流動相中乙腈比例對4 種有機酸分離效果的影響Fig.4 The effect of acetonitrile percentage in mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖4 可知，隨著有機相比例的不斷增加，4 種有機酸的保留時間也不斷縮短，且峰形、分離度和響應信號均發(fā)生了較大變化。對比3 個圖可知，當乙腈添加比例為0 時，4 種有機酸能達到很好的分離效果；而當乙腈的添加比例為5%或10%時，4 種有機酸并不能達到相應的分離效果，且與不添加乙腈相比，添加乙腈以后的檢測基線并不穩(wěn)定且噪音較大。因此，本研究選擇不添加乙腈。

2.1.5 流速的選擇

流動相流速為 0.05、0.80、1.00、1.20 mL/min 時對 4種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖5所示。

圖5 流動相流速對4 種有機酸分離效果的影響Fig.5 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 4 kinds organic acids

由圖5 可知，流速對4 種有機酸的保留時間的峰形具有較大影響，隨著流速的增加，4 種有機酸的保留時間會有明顯的縮短，值得注意的是，當流速為1.00 mL/min和1.20 mL/min 時，檸檬酸的保留時間并沒有較大差異。由圖5 亦可知，隨著流速的降低，4 種有機酸峰寬逐漸增加，且出現(xiàn)較為明顯的拖尾現(xiàn)象，而對比流速為1.00 mL/min 和1.20 mL/min 時的色譜圖發(fā)現(xiàn)，流速為1.20 mL/min 時檸檬酸的峰形較差且壓力相對較高。因此，本研究選擇流速為1.00 mL/min。

2.1.6 柱溫的選擇

柱溫箱的溫度為25、30、35 ℃時對4 種有機酸保留時間及分離效果的影響如圖6所示。

圖6 柱溫對4 種有機酸分離效果的影響Fig.6 Effect of column temperature on the separation of 4 kinds organic acids

由圖6 可知，柱溫對于奎寧酸、蘋果酸和乳酸的保留時間并沒有較大影響，而對檸檬酸的保留時間影響卻較大，當柱溫為30 ℃時，單次分析時間最短。由圖6亦可知，當柱溫為25 ℃和35 ℃，蘋果酸、乳酸和檸檬酸的峰形相較于30 ℃時的峰形差。因此本研究選擇柱溫為30 ℃。

2.2 獼猴桃酒中4 種有機酸含量的測定

2.2.1 標準回歸方程

分別以4 種有機酸的濃度為自變量x，色譜峰面積為因變量y 進行標準曲線回歸方程的計算，結(jié)果如表1。

表1 4 種有機酸回歸方程Table 1 Linear regression equations of detection for 4 kinds organic acids

由表1 可知，4 種有機酸的線性回歸方程的相關系數(shù)均在0.999 0 以上，可見各有機酸在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系。同時其檢出限在4.50 mg/L～6.60 mg/L 之間，具有較高的精度，可以滿足試驗要求。

2.2.2 獼猴桃酒中4 種有機酸含量的測定

使用HPLC 法對10 個獼猴桃酒樣品中4 種有機酸測定的結(jié)果如表2所示。

表2 HPLC 法測定獼猴桃酒中4 種有機酸含量（n=10）Table 2 Contents of 4 kinds organic acids in 10 kiwifruit wine samples（n=10）

由表2 可知，10 種獼猴桃酒中均檢測出奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸，其含量范圍分別為7.83 mg/mL～8.60 mg/mL、7.17 mg/mL ～7.66 mg/mL、0.84 mg/mL ～0.94 mg/mL 和 4.53 mg/mL～6.09 mg/mL。由此可見，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸為獼猴桃酒中的主要有機酸。

2.3 方法性能研究

2.3.1 精密性試驗結(jié)果

將1.2.1.2 中的供試樣品溶液連續(xù)進樣7 次，分別對4 種有機酸的峰面積進行測定，然后計算其相對標準偏差值（relative standard deviation，RSD），精密度試驗結(jié)果如表3所示。

由表3 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的相對標準偏差值均在0.10%以下，因而使用本研究優(yōu)化的色譜條件測定獼猴桃酒中4 種有機酸時具有良好的精密性。

2.3.2 重復性試驗結(jié)果

按照1.2.2.2 中的色譜條件對GJ1 獼猴桃果酒中各有機酸含量進行測定，試驗重復操作7 次，計算4 種有機酸峰面積的RSD，重復性試驗結(jié)果如表4所示。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Precision experiment results

表4 重復性試驗結(jié)果Table 4 Repetitive test results

由表4 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的相對標準偏差值均在1.00%以下，因而使用本研究優(yōu)化的色譜條件測定獼猴桃酒中4 種有機酸時具有良好的重復性。

2.3.3 加標回收試驗結(jié)果

參照1.2.2.2 中的色譜條件進行加標回收率試驗，其結(jié)果如表5所示。

由表5 可知，奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸其平均回收率分別為100.19%、99.64%、99.25%和99.67%，因而使用本研究優(yōu)化的色譜條件測定獼猴桃酒中4 種有機酸時可以很好的滿足試驗要求。

表5 加標回收率試驗結(jié)果Table 5 Spiking recovery test results

續(xù)表5 加標回收率試驗結(jié)果Continue table 5 Spiking recovery test results

3 結(jié)論

本研究建立了反相高效液相色譜法快速測定獼猴桃酒中奎寧酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸的方法，流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀，pH 值2.90，色譜柱為InertSustainSwift C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.00 mL/min，柱溫為 30 ℃，進樣量為 20 μL，檢測波長為215 nm，采用該方法分析發(fā)現(xiàn)，奎寧酸、蘋果酸和檸檬酸為獼猴桃酒中的主要有機酸。