陳菁，劉旭，楊碩，羅光偉

(武漢市第一醫(yī)院，武漢430022)

目前，臨床常用的肺癌病理診斷方法有痰脫落細胞檢查、纖維支氣管鏡檢查、經(jīng)皮穿刺肺活檢以及支氣管肺泡灌洗術(BALF)等[1～6]。其中，痰脫落細胞檢查是惟一無創(chuàng)的病理診斷方法，但陽性率明顯偏低；纖維支氣管鏡檢查是常用的病理檢查手段，中央型肺癌的確診率可達100%，但對于周圍型病變確診率僅在20%～65%[7]；經(jīng)皮穿刺肺活檢經(jīng)過多年的改進和完善已成為肺癌尤其是周圍型肺癌病理診斷的主要手段[8]，但該法易導致氣胸、出血等并發(fā)癥。BALF陽性細胞檢出率較痰脫落細胞檢查顯著增高[9,10]，且輔以液基細胞學檢測(LCT)對傳統(tǒng)涂片檢查的改進，使該法在臨床上的應用越來越多。p63和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(TTF-1)分別為診斷肺鱗癌和腺癌的特異性分子標志物，可用于肺癌的分型診斷。近年來，我們團隊針對BALF檢查方法進行改進，設計了一種新型支氣管肺泡灌洗導管(專利號：201720265388.7)，以進一步提升該檢查方法在周圍型肺癌患者病理組織學診斷中的應用價值。本研究分別應用傳統(tǒng)和自制新型支氣管肺泡灌洗裝置對周圍型肺癌患者進行BALF檢查，比較了在引起患者不適反應、采集的細胞質(zhì)量、診斷的準確性等方面的差異，以驗證該裝置對BALF檢查的改善提升作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年8月～2017年2月，在通過結(jié)合患者主訴與影像學分析初步判定為肺癌的患者中，對其中適于應用BALF檢查者分別選用傳統(tǒng)支氣管肺泡灌洗導管裝置和自制新型導管裝置進行檢查。納入術后組織病理學檢查確診為周圍型肺癌者121例，男93例、女28例，年齡37～75歲，鱗癌82例、腺癌39例。其中，使用傳統(tǒng)灌洗裝置者74例(對照組)，男56例、女18例，年齡39～75歲，腺癌22例、鱗癌52例；使用自制新型灌洗裝置者47例(觀察組)，男37例、女10例，年齡37～72歲，腺癌17例、鱗癌30例。兩組性別、年齡及病理類型具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 BALF檢查及患者不適反應觀察 按照中華醫(yī)學會制定的《支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規(guī)范(草案)》，使用傳統(tǒng)或自制新型支氣管肺泡灌洗導管裝置進行檢查。檢查獲得的病理標本部分用于LCT制片，部分凍存于液氮中以備PCR檢測。同時，記錄患者行BALF檢查過程中及檢查后出現(xiàn)的不適反應。自制新型支氣管肺泡灌洗導管裝置，見圖1。

注：灌水口(1)，進水導管(2)，出水孔(3)，吸水孔(4)，吸水導管(5)，回收口(6)，硅膠乳頭(7)，儲水倉(8)，回收導管(9)，負壓導管(10)，負壓泵(11)，連接件(12)，注射器(13)；進水導管(2)和吸水導管(5)在連接件(12)內(nèi)分別匯合成一支直徑為2 mm的總導管；吸水孔(4)的高度位于出水孔(3)的下側(cè)。

圖1 新型支氣管肺泡灌洗導管示意圖

1.3 LCT檢查 取部分BALF檢查獲得的病理標本，離心后進行LCT制片；以95%乙醇固定15 min，分別經(jīng)蘇木素和橙黃染液染色；脫水、透明后進行封片，常規(guī)巴氏染色；由2位病理科醫(yī)師同時顯微鏡下拍照、閱片、判讀，并觀察制片細胞的數(shù)量和質(zhì)量。

1.4 TTF-1、p63 mRNA表達檢測 采用Real-time PCR法。取凍存于液氮中的剩余部分BALF，提取總RNA并定量；于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA產(chǎn)物為模板，進行Real-time PCR擴增目的基因片段。TTF-1上游引物5′-CGTTCTCAGTGTCTGACATCTTGA-3′，下游引物5′-CCTCCATGCCCACTTTCTTG-3′；p63上游引物5′-GGAAAACAATGCCCAGACTC-3′，下游引物5′-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3′，下游引物5′-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3′；反應條件：95 ℃預變性5 min，按95 ℃ 30 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循環(huán)35次。實驗重復3次，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析TTF-1和p63 mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組BALF檢查不適反應比較 觀察組未出現(xiàn)不適反應；對照組出現(xiàn)不適反應共6例(8.1%)，其中僅出現(xiàn)胸痛4例，兼有咳嗽、發(fā)熱、胸痛2例(其中1例發(fā)生出血)。觀察組不適反應少于對照組(P=0.048)。

2.2 兩組LCT制片細胞數(shù)量和質(zhì)量、診斷肺癌及其分型的準確性比較 觀察組細胞鋪片比較分散、均勻，腫瘤細胞很清楚；對照組多出現(xiàn)炎性細胞較多，分布不均勻，腫瘤細胞難以分辨。低倍鏡下(100×)，單視野觀察組腫瘤細胞數(shù)量為(76±12)個，高于對照組的(25±18)個(P=0.002)。觀察組檢出腺癌13例(76.5%)、鱗癌26例(86.7%)、總檢出率83.0%，對照組檢出腺癌14例(63.6%)、鱗癌31例(59.6%)、總檢出率60.8%，觀察組鱗癌、肺癌總檢出率均高于對照組(P均=0.010)。

2.3 兩組灌洗細胞中TTF-1、p63 mRNA表達水平對肺鱗癌和腺癌診斷價值的比較 見表1。

表1 兩組灌洗細胞中TTF-1、p63 mRNA表達比較

注：與同組腺癌比較，*P<0.01。

ROC分析顯示，對照組以0.303為p63 mRNA診斷肺鱗癌的界值，其診斷靈敏度為0.860、特異度為0.873；以0.287為TTF-1 mRNA診斷肺腺癌的界值，其診斷靈敏度為0.873、特異度為0.808。觀察組以0.229為p63 mRNA診斷肺鱗癌的界值，其診斷靈敏度為0.921、特異度為0.915；以0.204為TTF-1 mRNA診斷肺腺癌的界值，其診斷靈敏度為0.880、特異度為0.903。與對照組比較，觀察組采集的標本檢測結(jié)果兩指標臨界值有所下調(diào)，但靈敏度和特異度均提高。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，肺腺癌和鱗癌有明顯的致癌性突變和不同的治療反應，這就推動了非小細胞肺癌(NSCLC)精確的病理分型。例如，貝伐單抗禁用于鱗癌，這種藥物增加鱗癌患者的肺出血風險。肺癌分型已成為治療的關鍵，可指導個性化治療。目前，除在術后對手術切除病理組織進行常規(guī)病理檢查作為病理分型的金標準外，臨床還有在術前對病理診斷的迫切需求。BALF檢查創(chuàng)傷輕微且不良并發(fā)癥較少，因而被廣泛應用。

BALF是通過纖維支氣管鏡對支氣管以下肺段或亞肺段水平，反復以無菌生理鹽水灌洗、回收，對其進行一系列檢測和分析，從而獲得下呼吸道病變的性質(zhì)特點和活動程度，有助于明確診斷。傳統(tǒng)方式通過一根導管將生理鹽水注入人的支氣管肺泡內(nèi)，通過內(nèi)腔鏡觀察水位，當支氣管肺泡充滿水后才能進行回收，因此易造成患者嗆水咳嗽以及回收不充分；該操作必須大量灌入生理鹽水，因此對醫(yī)師的技術要求特別高；而且，充水后生理鹽水會流向其他地方，回收的生理鹽水也有被其他地方污染的情況，無法進行精確的病理查找。

本研究應用擁有實用新型發(fā)明專利的自制新型灌洗導管裝置，目的在于解決現(xiàn)有裝置在應用中易出現(xiàn)的問題。該裝置有進水導管，其頂端開有灌水口，灌水口上接通有注射器；進水導管的端部固定安裝在連接件的內(nèi)腔中，連接件的內(nèi)腔中還設有吸水導管；吸水導管的頂端設有回收口，回收口的頂端螺紋連接有回收導管；回收導管的端部延伸至儲水倉的內(nèi)腔中，儲水倉的內(nèi)腔中還插接有負壓導管；所述進水導管和吸水導管在連接件內(nèi)分別匯合成一支總導管(直徑2 mm)，其底端密封套接有硅膠乳頭；硅膠乳頭的一側(cè)開有出水孔，另一側(cè)開有吸水孔，且吸水孔的高度位于出水孔的下側(cè)。與現(xiàn)有技術相比，該裝置中直徑2 mm的總導管插入時，人體的不適感減弱；硅膠乳頭的設置，防止主導管的端部對肺泡造成傷害；回收導管將人體肺泡內(nèi)的積水抽出，暫經(jīng)過儲水倉儲存；控制負壓泵工作，通過負壓導管將儲水倉內(nèi)的積水抽出，從而避免回收不充分。本研究結(jié)果顯示，觀察組未引起不適反應，大大提高了BALF檢查灌洗的效率；所收集的細胞標本制片后，細胞鋪片比較分散、均勻，腫瘤細胞很清楚，鏡下視野中腫瘤細胞數(shù)量顯著增多；而對照組所獲細胞樣本制片后出現(xiàn)炎性細胞太多、分布不均勻、腫瘤細胞難以辨別等情況，可見新型裝置所得灌洗細胞質(zhì)量明顯優(yōu)于傳統(tǒng)裝置。并且，應用不同裝置采集的病理標本進行LCT制片，新型裝置采集的標本肺癌檢出率更高。

研究表明，肺腺癌和鱗癌幾乎不重疊共表達TTF-1和p63[11，12]。因此，本研究以二者作為判定周圍型肺癌病理分型的標志物，在灌洗細胞樣本中采用Real-time PCR法對其表達水平進行檢測，結(jié)果表明二者在腺癌和鱗癌兩種病理分型中呈現(xiàn)明顯的分化表達趨勢；以表達水平對肺腺癌和鱗癌兩種病理分型進行診斷，發(fā)現(xiàn)應用新型裝置采集的灌洗細胞樣本檢測分子指標的表達水平進行診斷，可明顯提高診斷的靈敏度和特異度，診斷價值優(yōu)于傳統(tǒng)灌洗裝置。

綜上所述，本研究表明自制新型支氣管肺泡灌洗導管裝置用于BALF檢查，可以有效降低灌洗過程中患者的不適感，提高了灌洗的效率，采集到的灌洗細胞樣本質(zhì)量好，用于分子標志物表達水平檢測進行肺癌分型時具有更好的診斷價值，適宜在臨床推廣應用。