易葉葉 況 燕 蒙家華 楊慧蘭 徐 紅 侯海瑞

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧市 530021，電子郵箱：1036240289@qq.com)

卵巢癌的病死率居女性惡性腫瘤的首位，預(yù)后不良，嚴(yán)重威脅著許多女性的生命健康[1-2]。由于其早期臨床癥狀不明顯或與其他良性婦科疾病癥狀相似，大部分卵巢癌患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)其腫瘤已轉(zhuǎn)移到腹膜表面，就診時(shí)已處于疾病晚期，治療難度大,易復(fù)發(fā),預(yù)后差。盡管目前臨床上針對(duì)卵巢癌的治療方法不斷改進(jìn),患者的總生存期仍然很差，5年生存率無明顯改善[3]。因此,探索卵巢癌的發(fā)病機(jī)制,開發(fā)新的腫瘤診斷標(biāo)志物，有利于卵巢癌的早期診斷和治療。本研究采用免疫組化法分析組蛋白去甲基化酶—賴氨酸特異性脫甲基酶2B[lysine(K)-specific demethylase 2B,KDM2B]、凋亡抑制基因蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)，以及促進(jìn)凋亡基因蛋白-Hrk蛋白在卵巢癌中的表達(dá)情況，并其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年12月至2018年9月在我院進(jìn)行診治的100例卵巢疾病患者的卵巢組織標(biāo)本，包括20例正常卵巢組織(來源于子宮肌瘤或子宮腺肌病并行全子宮雙附件切除術(shù)的患者)，30例良性卵巢腫瘤(13例漿液性囊腺瘤和17例黏液性囊腺瘤)，42例上皮性卵巢癌(25例漿液性腺癌、10例黏液腺癌、6例子宮內(nèi)膜樣癌和1例鱗狀細(xì)胞癌)，8例非上皮性卵巢癌(5例未成熟畸胎瘤、2例肉瘤及1例卵黃囊瘤)。所有病例在取材前均未接受放、化療及免疫治療，且均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 兔抗人KDM2B多克隆抗體(批號(hào)：ab85807)購自CST公司，兔抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體購自博士德公司(批號(hào)：A00040-1)，兔抗人Hrk蛋白多克隆抗體(批號(hào)：ab45419)購自Abcam公司；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)試劑盒(批號(hào)：PV-6001)和二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(批號(hào)：ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白、Hrk蛋白的表達(dá)情況,具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，其中KDM2B、Bcl-2蛋白、Hrk蛋白抗體工作液濃度分別為1 ∶500、1 ∶100、1 ∶50,以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照,以已知陽性切片作為陽性對(duì)照。最后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用Volm雙評(píng)分法[4]進(jìn)行結(jié)果判定，陽性定義為在胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃褐色顆粒，其著色強(qiáng)度明顯高于背景非特異性染色。從400倍高倍鏡下，每張切片均隨機(jī)取5個(gè)視野,每個(gè)視野根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度計(jì)分。陽性細(xì)胞的百分比計(jì)分：<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。染色程度計(jì)分:不著色計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分。把兩者分?jǐn)?shù)相乘作為最終判定結(jié)果:0分為陰性(-),1～2分為弱陽性(+),3～4分為中度陽性(++),≥5分為強(qiáng)陽性(+++)。其中(+)、(++)、(+++)均為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白的陽性表達(dá)情況 惡性卵巢腫瘤的KDM2B、Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率明顯高于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(均P<0.05),惡性卵巢腫瘤組織、良性卵巢腫瘤組織、正常卵巢組織的Hrk蛋白陽性表達(dá)率依次升高(均P<0.05)，見表1及圖1。

表1 不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

注：與正常卵巢組織比較，*P<0.05；與良性卵巢腫瘤組織比較，#P<0.05。

圖1 不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白表達(dá)情況(SP法，×400)

注：1A、1B、1C分別為正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、惡性卵巢腫瘤組織中KDM2B的表達(dá)；2A、2B、2C分別為正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、惡性卵巢腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)；3A、3B、3C分別為正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、惡性卵巢腫瘤組織中Hrk蛋白的表達(dá)。

2.2 KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白表達(dá)情況與惡性卵巢組織臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 低分化、國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的KDM2B及Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率均分別高于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例(均P<0.05)，而Hrk蛋白陽性表達(dá)率均分別低于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例(均P<0.05)。不同年齡段病例的3種蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2～4。

表2 KDM2B表達(dá)情況與惡性卵巢腫瘤患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表3 Bcl-2蛋白表達(dá)與惡性卵巢腫瘤患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表4 Hrk蛋白表達(dá)與卵巢癌腫瘤患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 惡性卵巢腫瘤組織中KDM2B、Bcl-2蛋白表達(dá)與Hrk蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在惡性卵巢癌腫瘤組織中，KDM2B、Bcl-2蛋白的陽性表達(dá)率均與Hrk蛋白的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.581,P=0.023；rs=-0.341,P=0.008)。

3 討 論

組蛋白去甲基化酶KDM2B也稱為NDY1、JHDM1B或FBXL10，屬于JHDM家族。由KDM2B基因編碼的蛋白質(zhì)包含含有Jumonji C結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、植物同源結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸的區(qū)域和富含亮氨酸的重復(fù)序列。其中，Jumonji C結(jié)構(gòu)域是催化H3K36me2和H3K4me3去甲基化的活性中心，并且可以通過其含鋅指結(jié)構(gòu)的半胱氨酸區(qū)域與CpG島結(jié)合[5-6]。KDM2B在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、衰老、凋亡、核糖體RNA表達(dá)及造血干細(xì)胞自我更新等多方面發(fā)揮重要作用[7-8]；其在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常,被認(rèn)為是一種致癌基因[9-11]。Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)KDM2B在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),敲低KDM2B表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞生長和增殖；Tzatsos等[10]發(fā)現(xiàn)KDM2B在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)及轉(zhuǎn)移有關(guān)，沉默KDM2B能消除胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的致瘤性。以上結(jié)果均提示KDM2B可能參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，惡性卵巢腫瘤組織的KDM2B陽性表達(dá)率明顯高于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(均P<0.05)，且低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性卵巢腫瘤病例的KDM2B陽性表達(dá)率均分別高于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例(均P<0.05)，這與Kuang等[11]的研究結(jié)果相似。這提示KDM2B也可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

Bcl-2蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的Bcl-2蛋白家族的創(chuàng)始成員，Bcl-2蛋白家族可以分為兩大類:Bcl-2蛋白類,是抑制凋亡因子；Bcl-2蛋白相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)類,是促進(jìn)凋亡因子[12-13]。目前，已有研究表明Bcl-2蛋白基因的損傷導(dǎo)致了多種惡性腫瘤的發(fā)生，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[14-16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白在鱗狀細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，其陽性表達(dá)率與腫瘤組織學(xué)分化程度、TNM分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。有研究證實(shí)，miR-16通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞活性和遷移能力,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白在惡性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率高于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(P<0.05),且Bcl-2蛋白的表達(dá)陽性率隨著惡性卵巢腫瘤組織分級(jí)及FIGO分期的增加而升高(P<0.05)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Bcl-2蛋白的陽性表達(dá)率增高(P<0.05)。這提示Bcl-2蛋白與卵巢癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。

Hrk蛋白屬于凋亡相關(guān)蛋白BH3亞家族成員。有研究表明，BH3亞家族成員均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，起到腫瘤抑制因子的作用，Hrk蛋白通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白或Bcl-xL結(jié)合，形成異二聚體活化Bax，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-20]。有學(xué)者報(bào)道，Hrk蛋白在乳腺癌中低表達(dá)，其表達(dá)水平與乳腺癌高病理分級(jí)和低臨床分期有關(guān)，七失神同源物1可通過上調(diào)Hrk蛋白表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡,在乳腺癌形成中發(fā)揮重要作用[20]。研究表明，Hrk蛋白表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)前列腺癌和卵巢癌細(xì)胞凋亡[21-22]。另有研究顯示，Hrk蛋白在胃癌組織中表達(dá)水平低于癌旁組織，可能參與調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展[23]。本研究結(jié)果顯示，Hrk蛋白在惡性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率低于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(P<0.05),且Hrk蛋白陽性表達(dá)率隨著惡性卵巢腫瘤組織分級(jí)及FIGO分期的增加而降低(P<0.05)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Hrk蛋白的陽性表達(dá)率較低(P<0.05)。提示Hrk蛋白表達(dá)下調(diào)可能在卵巢發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮一定作用。

Wang等[24]對(duì)多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，沉默KDM2B的表達(dá)后Hrk蛋白的表達(dá)增加，這初步說明 KDM2B能調(diào)控Hrk蛋白的表達(dá)。而本研究結(jié)果也顯示，在惡性卵巢腫瘤組織中KDM2B與Hrk蛋白的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。而Hrk蛋白是三甲基化組蛋白H3賴氨酸27的直接靶基因,其在腫瘤中的低表達(dá)與其本身DNA甲基化有關(guān)，此外KDM2B能促進(jìn)組蛋白H3賴氨酸27的三甲基化[23，25-26]。由此，我們推測(cè)KDM2B可能通過促進(jìn)H3K27三甲基化進(jìn)而調(diào)節(jié)Hrk蛋白的表達(dá)，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Hrk蛋白直接作用的分子主要有Bcl-2蛋白家族和Bcl-xL。Hrk蛋白通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白或Bcl-xL結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是一種促凋亡蛋白[19-20]。有研究顯示Bcl-2蛋白與Hrk蛋白蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2蛋白抗凋亡基因作用受到Hrk蛋白促凋亡蛋白影響，二者之間有相互促進(jìn)作用[23]。本研究結(jié)果也顯示，在惡性卵巢腫瘤組織中Bcl-2蛋白與Hrk蛋白的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。因此，我們推測(cè)Bcl-2蛋白與Hrk蛋白共同參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,卵巢癌中KDM2B與Bcl-2蛋白的表達(dá)上調(diào)，Hrk蛋白的表達(dá)下調(diào)，三者可能通過不同的方式參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。這可能成為卵巢癌轉(zhuǎn)歸及判斷預(yù)后的參考指標(biāo)，為臨床的靶向治療提供新思路。