于穎 李理 榮紹豐 管世敏

摘 要 目的：研究從發(fā)酵菌絲中提取甲殼素的工藝。方法：以曲霉菌絲體為原料，破壁處理，然后分別采用HCl溶液和NaOH溶液處理脫除礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，提取甲殼素。通過單因素試驗優(yōu)化了酸處理和堿處理條件，最終確定了甲殼素提取工藝：HCl濃度為1.0 mol/L，固液比1∶20，處理溫度10 ℃，浸泡時間12 h；抽濾去除酸液，用純化水清洗菌體粉末至pH中性；NaOH濃度為2.0 mol/L，固液比1∶20，處理溫度20 ℃，浸泡時間5 h，連續(xù)處理3次。結(jié)果：在此條件下得到的甲殼素灰分含量0.98%，殘留蛋白質(zhì)含量0.64%，菌體收率為41.15%。結(jié)論：該提取工藝制備得到的甲殼素產(chǎn)率高，灰分和雜蛋白含量少，且品質(zhì)、色澤、殘留灰分等方面優(yōu)于蝦蟹殼，提取工藝相對環(huán)保，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 赭曲霉 發(fā)酵 提取 甲殼素

中圖分類號：TQ920.6； TQ929 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）11-0066-05

Study on the process of chitin extraction from Aspergillus mycelium*

YU Ying1**， LI Li2， RONG Shaofeng2， GUAN Shimin2***

（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

ABSTRACT Objective： To study a process of chitin extraction from mycelia of Aspergillus ochraceus. Methods： Using Aspergillus mycelium as raw material， the conditions for acid and alkali treatment were optimized by single factor test and the extraction process was finally obtained. Results： Mycelia were soaked for 12 hours under the condition of solid-liquid ratio 1：20， 1 mol/L HCl at 10 ℃ for 12 h to remove mineral substances； socking with 2 mol/L NaOH at 20 ℃ for 5 h under the condition of solid-liquid ratio 1：20， repeat 3 times. The resultant chitin was with 0.89% of ash content， 0.74% of residual protein， the yield was 41.15%. Conclusion： The chitin prepared by the extraction process has high yield， low ash and impurity protein content， and its quality， color and residual ash are superior to that extracted from shrimp and crab shell， and the extraction process is relatively environmentally friendly， and is suitable for industrial production.

KEY WORDS Aspergillus； fermentation； extraction technology； chitin

甲殼素（chitin）又名幾丁質(zhì)、甲殼質(zhì)，是一種廣泛存在于自然界的天然高分子聚合物，主要存在于節(jié)肢動物如蝦、蟹的外殼和真菌及一些藻類植物的細胞壁中[1]。目前商品化的甲殼素主要為蝦、蟹殼提取制得，經(jīng)過脫礦物質(zhì)、脫蛋白和脫色處理[2]。微生物發(fā)酵法提取制備甲殼素是以菌絲體為原料采用酸堿交替法提取制得。與自蝦、蟹中提取甲殼素相比，微生物發(fā)酵法有如下優(yōu)勢[3]：①簡單發(fā)酵即可獲得甲殼素，不受原料來源地域、時間的局限；②利用稀酸、稀堿即可提取，工藝相對環(huán)保；③菌絲體無機物含量較低，無需礦化等繁瑣步驟；④無蝦、蟹來源的蛋白等過敏原；⑤易工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，真菌發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素/殼聚糖極具應用前景，盡管有大量關(guān)于真菌發(fā)酵制備甲殼素的研究，但是其工業(yè)化應用鮮有報道[4-5]。此外，甲殼素脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖和其酶解產(chǎn)物殼寡糖因生物活性更高，作為生物材料在醫(yī)療領(lǐng)域更具應用價值[6-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

赭曲霉MF010（保藏號CGMCCNo.15668）由上海應用技術(shù)大學微生物實驗室提供；甲殼素對照品（上海昊海生物科技股份有限公司，BR級）；NaOH [永華化學科技（江蘇）有限公司，分析純]；HCl（上海泰坦科技有限公司，分析純）。

MSA-0420攪拌機（上海沉匯儀器有限公司）；DHP-9272電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HH-1電熱恒溫水浴鍋（北京長源實驗設(shè)備廠）；BS210S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DJ-04粉碎機（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；SJL-1400馬弗爐（上海倨晶精密儀器有限公司）；PH-3C pH計[雷磁（上海）有限公司]；HYG-3C恒溫搖床（太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司）；SKD-800自動凱氏定氮儀（上海沛歐分析儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵方法

斜面培養(yǎng)：將甘油管中保藏的菌種于無菌操作下轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基中，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中26 ℃培養(yǎng)5 d。

種子培養(yǎng)：將斜面菌種于無菌操作下，刮取孢子并轉(zhuǎn)移至無菌生理鹽水中懸浮，按照10%接種量轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，在恒溫搖床中（26 ℃，180 r/min）培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將獲得的種子培養(yǎng)液，于無菌操作下按照10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫搖床中（26℃，180 r/min）培養(yǎng)40 h。

1.2.2 甲殼素提取

菌體破壁處理：發(fā)酵液抽濾取濾渣，按照質(zhì)量體積比，加入菌體濕重3倍的HCl溶液（質(zhì)量分數(shù)為1.8%），攪拌破壁處理1 h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，抽濾取濾渣，用純化水清洗濾渣至中性。濾渣用無水乙醇脫水2次后，置于烘箱中45 ℃烘干至恒重，獲得干菌絲體。

酸處理：比較酸濃度、酸處理時間、酸處理溫度和固液比對灰分去除和蛋白質(zhì)含量的影響[10]。

堿處理：比較堿濃度、堿處理溫度、堿處理時間、固液比對蛋白質(zhì)去除和收率的影響[10]。

1.3 檢測方法

灰分測定：參照中華人民共和國藥典灰分測定法測定[11]。

蛋白質(zhì)含量測定：參照中華人民共和國藥典凱氏定氮法測定[11]附錄88-89。

2 結(jié)果

2.1 酸處理

2.1.1 酸濃度對菌體中灰分去除及蛋白質(zhì)含量的影響

HCl濃度在0.0～1.0 mol/L時，隨著HCl濃度的增加灰分含量逐漸下降，脫除無機鹽效果明顯，灰分從初始的3.41%降低至1.45%，蛋白質(zhì)含量由25.34%降低至16.32%，菌體收率為71.31%；HCl濃度超過1.0 mol/L后，其灰分含量下降趨勢不明顯，當HCl濃度增加到5.0 mol/L時，灰分含量為0.76%，蛋白質(zhì)含量為15.87%，菌體收率為53.85%。在實際操作中，HCl濃度過高會使反應速率過快而不易控制，且隨著HCl濃度的增加甲殼素易于水解，因此，HCl濃度為1.0 mol/L較合適（圖1）。

2.1.2 酸處理時間對菌體中灰分去除及蛋白質(zhì)含量的影響

反應時間在0～12 h，隨著酸浸泡時間的增加，灰分含量急劇下降，由3.41%降低至0.96%，蛋白質(zhì)含量由25.34%降低至15.99%，菌體收率由100%降低至64.81%，脫除無機鹽效果明顯。當反應時間超過12 h，其灰分含量、蛋白質(zhì)含量以及菌體收率下降趨勢減緩；17 h以后，HCl與鈣鹽的反應基本達到平衡，再延長時間對脫除無機鹽效果的影響不大，但菌體收率卻降低很多，因此，選擇酸處理時間12 h更為合適（圖1）。

2.1.3 酸處理溫度對菌體中灰分去除及蛋白質(zhì)含量的影響

隨著反應溫度的升高，無機鹽脫除效果越好，灰分顯著降低。當反應溫度在-10～10 ℃時，隨著溫度的升高，脫除無機鹽的效果較好，灰分由3.41%降低至0.98%，菌體收率由100%降低至67.51%，蛋白質(zhì)含量由25.34%降低至16.35%。當反應溫度高于10 ℃時，隨著溫度的升高，灰分含量及蛋白質(zhì)含量下降緩慢，菌體收率由67.51%降低至32.27%，且菌絲體顏色變深且不易除去。考慮成本、菌體收率及脫除無機鹽效果等因素，酸處理溫度控制在10 ℃較為合適（圖1）。

2.1.4 酸處理固液比對菌體中灰分去除及蛋白質(zhì)含量的影響

隨著固液比的增高，灰分含量、蛋白質(zhì)含量及菌體收率均有不同程度的下降。當固液比達到1∶10，菌體總蛋白質(zhì)含量下降至15.98%，繼續(xù)增高固液比不能使蛋白質(zhì)含量繼續(xù)大幅降低。當固液比為1∶10，1∶20時，灰分含量分別為0.96%，0.67%，繼續(xù)增高固液比，灰分含量下降不明顯。隨著固液比增高，菌體收率下降幅度明顯，當固液比為1∶10，1∶20時，菌體收率分別為67%，65%，當固液比繼續(xù)增高，收率下降幅度加大，當固液比為1∶50時，菌體收率僅為38%（圖1）?？傮w來看，在保證菌體收率盡可能高的前提下，固液比為1∶20，蛋白質(zhì)及灰分去除效果最好。因此，最佳固液比為1∶20。

2.2 堿處理

2.2.1 堿濃度對蛋白質(zhì)去除和收率的影響

隨著NaOH濃度的提高，蛋白質(zhì)去除的效果越好。當NaOH濃度為2 mol/L時，蛋白質(zhì)含量為3.48%，菌體收率為49.54%，灰分含量為1.03%，當NaOH濃度為5 mol/L時，蛋白質(zhì)含量為2.97%，菌體收率為45.39%，灰分含量為1.39%，對蛋白質(zhì)去除的影響效果不大，且隨著NaOH濃度的增加，易使幾丁質(zhì)脫乙?；蓺ぞ厶?，因此，選擇濃度為2 mol/L的NaOH溶液堿處理（圖2）。

2.2.2 堿處理時間對蛋白質(zhì)去除和收率的影響

在反應的初始階段，隨著堿處理時間的延長，蛋白質(zhì)含量急劇下降，蛋白去除效果明顯，反應5 h后，蛋白含量從19.95%降低為3.75%，灰分含量由0.56%增加為0.84%，而菌體收率由63.92%降低為50.58%；堿處理時間在5～14 h，蛋白質(zhì)含量下降趨勢減緩，由3.49%降低為0.68%，而灰分含量由0.84%增加為1.20%，菌體收率損失較大，由50.58%降低為35.28%。一般來說，蛋白質(zhì)去除時間越長水解越徹底，考慮到長時間反應會帶來生產(chǎn)成本上的增加，因此，選擇堿處理時間5 h為宜（圖2）。

2.2.3 堿處理固液比對蛋白質(zhì)去除和收率的影響

從理論來說，固液比越大，蛋白質(zhì)去除的效果越好。當固液比從1∶0增加到1∶20時，蛋白質(zhì)含量由19.95%降低為3.58%，灰分含量從0.56%升高為0.85%，菌體收率從63.92%降低為43.97%。當固液比1∶20增加到1∶50時，蛋白質(zhì)含量由3.58%降低為1.32%，灰分升高了0.42%，菌體收率由43.97%降低為30.02%，即當固液比大于1∶20時，對蛋白質(zhì)的去除影響不大，且菌體收率損失較大，廢水排放量增多，所以選擇固液比1∶20為宜（圖2）。

2.2.4 堿處理溫度對蛋白質(zhì)去除和收率的影響

隨著堿處理溫度的升高，蛋白質(zhì)含量略有下降，當溫度為20 ℃時，蛋白含量降低為1.56%，灰分含量增加為1.06%，菌體收率降低為47.71%；當溫度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)去除效果不明顯，溫度從20 ℃增加到80 ℃時，蛋白含量由1.56%降低為1.08%，灰分含量由1.06%增加為1.36%，而菌體收率卻由47.71%降低為32.10%，菌體收率損失較大。溫度對NaOH水解蛋白質(zhì)影響較大，在其它條件固定的情況下，反應溫度越高，蛋白質(zhì)堿水解的速度越快；但溫度達到20 ℃時，蛋白質(zhì)的堿水解反應趨于平衡，繼續(xù)升溫對蛋白質(zhì)去除的效果不明顯。因此，選擇堿處理溫度20 ℃為宜（圖2）。

2.2.5 堿處理次數(shù)對蛋白質(zhì)去除和菌體收率的影響

隨著堿處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)、灰分及菌體收率均有所下降。堿處理2次，灰分含量為0.92%、蛋白含量為0.94%、收率為42.73%。堿處理3次，灰分含量為0.98%、蛋白含量為0.64%、收率為41.15%。3次堿處理雖然會降低最終收率，但蛋白質(zhì)含量可以降低至1.0%以下，所以，選擇3次堿處理為宜（圖2）。

2.3 最佳工藝的試驗結(jié)果

確定甲殼素提取的最佳工藝條件：HCI濃度為1.0 mol/L，固液比1∶20，處理溫度10 ℃，浸泡時間12 h；然后抽濾去除酸液，用純化水清洗菌體粉末至pH中性；NaOH濃度為2.0 mol/L，固液比1∶20，處理溫度20 ℃，浸泡時間5 h，連續(xù)處理3次。處理后的菌體粉末于45℃烘箱烘干2 h，得到的白色粉末即為甲殼素。在以上工藝條件下展開3次平行實驗的結(jié)果如表1。

3 討論

本實驗采用單因素試驗從發(fā)酵菌絲體中提取甲殼素的工藝進行了研究，分析提取工藝的不同反應條件對甲殼素中殘留灰分、蛋白含量以及產(chǎn)率的影響，最終確定了甲殼素提取的最佳工藝條件。在以上工藝條件下制備的甲殼素為白色粉狀固體，產(chǎn)量能達到5 g/L，且品質(zhì)、色澤、殘留灰分等方面均優(yōu)于蝦蟹殼[12-13]，灰分含量為0.98%，殘留蛋白質(zhì)含量為0.64%，菌體收率為41.15%，提取工藝相對環(huán)保。后續(xù)的研發(fā)工作將主要圍繞無動物源發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及中試放大，建立適于工業(yè)放大的曲霉MF010發(fā)酵生產(chǎn)甲殼素的發(fā)酵工藝和提取工藝。

參考文獻

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摘 要 西他沙星是第四代喹諾酮類抗菌藥物，D-3是其酸降解雜質(zhì)中的一種。本研究通過制備性薄層色譜法分離在西他沙星合成過程中產(chǎn)生的D-3，并用核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）和核磁共振二維相關(guān)譜1H-1HCOSY、DEPT135、HSQC、HMBC對分離的D-3進行結(jié)構(gòu)歸屬解析。

關(guān)鍵詞 西他沙星 D-3 核磁共振二維譜解析

中圖分類號：O657.61； R978.19 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）11-0071-04

Separation of sitafloxacin-related substance D-3 and its analysis of molecular structure by using 2D-NMR

CHEN Bin*， LI Zhenye， LIU Xia， ZHANG Guiju， YU Xiang， XIE Yongju**（Jiangxi Fushine Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jiangxi Jingdezhen 333000， China）

ABSTRACT Sitafloxacin is the fourth-generation quinolone antibacterial agent and its substance D-3 is one of the degradation impurities. The D-3 produced in the synthesis was isolated by preparative thin-layer chromatography and its structure was elucidated using 1H-NMR， 13C-NMR， 1H-1HCOSY， DEPT135， HSQC and HMBC.

KEY WORDS sitafloxacin； D-3； 2D-NMR elucidation

西他沙星（sitafloxacin）是第四代喹諾酮類抗菌藥物，2008年在日本首先上市。西他沙星抗菌譜廣，特別是對呼吸道病原菌的抗菌活性較強，臨床上用于治療嚴重的難治性細菌感染、復發(fā)性感染以及某些耐藥菌感染。西他沙星的有關(guān)物質(zhì)D-3（圖1）是西他沙星酸降解雜質(zhì)中的一種，現(xiàn)還未見有其分離方法及其核磁共振譜圖信號歸屬的研究，僅見有用1H-NMR測定西他沙星含量的報告[1]。本文利用制備性薄層色譜法分離在西他沙星合成過程中產(chǎn)生的D-3，并用核磁共振一維譜和二維相關(guān)譜1H-1HCOSY、DEPT135、HSQC、HMBC對分離的D-3進行結(jié)構(gòu)歸屬解析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；UTP-313電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆?/p>

1.2 試劑

中間體Ⅰ（按文獻[2]合成）；氫化鈉（60%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二氧六環(huán)、濃鹽酸、冰醋酸、氯仿（均國藥集團化學試劑有限公司）；氘代二甲基亞砜（DMSO-d6，氘含量>99.8%、HDO<0.2%，加標1%，上海麥克林生化科技有限公司）；制備性硅膠板（20 cm×20 cm，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。

2 實驗方法

D-3的核磁共振波譜均用Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀檢測，波譜儀配有5 mm四核反向檢測探頭，檢測以DMSO-d6為溶劑、四甲基硅烷為內(nèi)標。1H-NMR檢測的觀測頻率為400 MHz，13C-NMR檢測的觀測頻率為100 MHz。DEPT135檢測的工作頻率及譜寬與13C-NMR相同。核磁共振實驗采用5 mm直徑的核磁管，一維、二維實驗均于控溫下進行。

3 D-3的分離

在100 ml四口燒瓶中依次加入中間體Ⅰ3.65 g、二氧六環(huán)36 ml，攪拌溶解，降溫至15 ～ 20 ℃后，再分批緩慢加入60% NaH 0.4 g，攪拌反應0.5 h，加入冰醋酸5 ml，繼續(xù)攪拌反應2 h。反應液于50 ～ 55 ℃下減壓蒸餾至干，固體以50 ml二氯甲烷溶解，然后滴加至25 ml水中，攪拌，靜置分層，分出有機相，減壓濃縮至固體析出，得中間體Ⅱ（圖2）。

在250 ml反應瓶中依次加入上述中間體Ⅱ、濃鹽酸17 ml、冰醋酸17 ml，攪拌，升溫至90 ～ 100 ℃反應12 h，再加入濃硫酸20 ml，升溫至105 ～ 120 ℃繼續(xù)反應15 d。降至室溫，反應液以200 ml乙酸乙酯分6次萃取，萃取液減壓濃縮至剩少量液體，然后進行制備性薄層色譜法分離[硅膠板規(guī)格20 cm×20 cm，展開劑乙酸乙酯∶甲醇=6∶1（體積比）]。當展開劑前沿到達硅膠板一定高度時取出硅膠板，熱風機吹干后重新放入展開缸，繼續(xù)展開（共3次，展開劑前沿到達的高度分別為硅膠板高度的55%、75%和95%處）。展開完成后，于254、365 nm的紫外燈下找到并分出D-3點（Rf=0.15）。分出的D-3點用20 ml乙腈浸泡5 ～ 6 h，過濾，濾液減壓蒸餾至干，得D-3 0.35 g（用HPLC檢測，純度為97.5%）。

4 D-3的核磁共振波譜解析

以DMSO-d6為溶劑，進行D-3的核磁共振波譜檢測。

1H-NMR譜圖（圖3）顯示，D-3分子中有多組質(zhì)子信號，共含7個質(zhì)子，部分活潑質(zhì)子未出峰。δ 2.50是溶劑的質(zhì)子信號。

13C-NMR譜圖（圖4）顯示，D-3分子中有多組碳信號，共含13個碳。

DEPT135譜圖（圖5）顯示，D-3分子中有1組仲碳、4組叔碳或伯碳，其余為季碳。依據(jù)HSQC譜圖（圖6）可以確認各組碳與氫的連接關(guān)系。

DEPT135譜圖顯示，δ 17.15（J=10 Hz）為仲碳，對應為C16。對應的HSQC譜圖中，δ 1.62 ～ 1.82（m， 2H）歸屬為H16。根據(jù)脂肪族碳的出峰規(guī)律，δ 42.07和δ 73.86（J=222 Hz）為高場碳，對應為環(huán)丙烷部分，結(jié)合氟對相連接的碳原子的裂分規(guī)律，因此δ 73.86（J=222 Hz）歸屬為C15，δ 42.07歸屬為C14。對應的HSQC譜圖中，δ 4.34（s， 1H）歸屬為H14，δ 5.13（d， J=64 Hz， 1H）歸屬為H15。

在DEPT135譜圖中，δ 153.89和δ 110.21（J=20 Hz）為叔碳，再依據(jù)HMBC譜圖（圖7），C14與δ 8.79（s， 1H）有相關(guān)，因此δ 8.79（s， 1H）歸屬為H5，δ 7.99（d， J=1.2 Hz， 1H）歸屬為H10。對應的HSQC譜圖中，δ 153.89歸屬為C5，δ 110.21（J=20 Hz）歸屬為C10。

在HMBC譜圖中，δ 176.71與H10有相關(guān)，根據(jù)羰基碳的出峰規(guī)律，δ 176.71歸屬為C3，δ 165.50歸屬為C19。

在HMBC譜圖中，δ 137.85與H5、H10均有相關(guān)，根據(jù)苯環(huán)間位相關(guān)信號增強的規(guī)律，δ 137.85歸屬為C1。δ 149.79（J=20 Hz）與H10有相關(guān)，因此δ149.79（J=20 Hz）歸屬為C8。根據(jù)氟對相連接的碳原子的裂分規(guī)律并結(jié)合芳香族碳的出峰規(guī)律，δ 150.57（J=246 Hz）歸屬為C9。δ 107.68與H5有相關(guān)，因此δ107.68歸屬為C4。根據(jù)氟對苯環(huán)其他碳原子的裂分規(guī)律以及δ 119.67與H5有弱相關(guān)，而δ 111.68與H5無弱相關(guān)，因此δ 119.67歸屬為C2，δ 111.68歸屬為C7。

依據(jù)1H-NMR譜圖并結(jié)合羧酸活潑氫的出峰規(guī)律，δ 14.59（br， 1H）歸屬為H21。

1H-1HCOSY譜圖（圖8）顯示，δ 1.62 ～ 1.82（m， 2H）的質(zhì)子與δ 4.34（s， 1H）、δ 5.13（d， J=64 Hz， 1H）的質(zhì)子有耦合關(guān)系，即H14、H15、H16為相鄰關(guān)系，驗證了上述1H-NMR譜圖的解析結(jié)果。

至此，D-3的1H-NMR和13C-NMR譜圖解析完畢，結(jié)構(gòu)歸屬結(jié)果歸納見表1和表2。

5 結(jié)語

本研究通過制備性薄層色譜法分離西他沙星有關(guān)雜質(zhì)D-3，并用1H-NMR、13C-NMR以及核磁共振二維相關(guān)譜DEPT135、HSQC、HMBC、1H-1HCOSY對分離的 D-3進行結(jié)構(gòu)歸屬解析，實現(xiàn)了西他沙星有關(guān)物質(zhì)D-3 1H-NMR和13C-NMR譜圖數(shù)據(jù)的全歸屬解析。

參考文獻

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