章淑艷 倪德勝 王維戚

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)具有自我更新和多向分化特性以及很強(qiáng)的免疫調(diào)控功能，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)以及多種疾病的細(xì)胞治療領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景[1-2]。然而，長(zhǎng)期體外培養(yǎng)會(huì)引起B(yǎng)MMSCs的功能改變，如表面標(biāo)志表達(dá)降低，增殖能力減低以及分化異常等，影響了BMMSCs的應(yīng)用[3-5]。因此，如何改善長(zhǎng)期體外培養(yǎng)BMMSCs的功能是目前再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療領(lǐng)域十分關(guān)注的問(wèn)題。

二甲雙胍(metfomin, Met)作為一種重要的糖尿病治療藥物，可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松模型的骨量恢復(fù)[6]。氧化應(yīng)激是衰老、骨質(zhì)疏松、糖尿病等病理?xiàng)l件下BMMSCs功能受損的重要因素[7]。近年來(lái)的研究表明Met具有抵抗氧化應(yīng)激的能力[8]。本研究旨在探討Met能否改善體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中BMMSCs的增殖和成骨分化功能，及其與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12 周齡雌性C57小鼠(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.1.2 主要試劑 主要試劑 α-MEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清(Invitrogen, 美國(guó))； Met、 茜素紅(Sigma， 美國(guó))； 0.25%胰蛋白酶(MPB iomedicals，美國(guó))； 細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)； BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)； 結(jié)晶紫(Amresco，美國(guó))； GENMED細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧(ROS)初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒(GenMed， 美國(guó))； TrizolReagent、 RT-PCR試劑盒(Takara，日本)； PCR引物由上海生工生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs分離培養(yǎng) 小鼠處死后置于75%酒精中5 min，取股骨及脛骨放于20%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿， 1 ml注射器將骨髓沖出，收集到離心管，吹散后均勻接種于塑料培養(yǎng)皿中， 37 ℃、 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)到80%左右，胰酶消化傳代。選取P1代和P6代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) MMSCs按照1×103/孔的密度接種于96 孔板，每孔接種200 μl培養(yǎng)液，檢測(cè)時(shí)每孔加入20 μl CCK-8，孵箱避光孵育2 h后， 酶標(biāo)儀讀取450 nm的吸光度值。連續(xù)檢測(cè)7 天，第0 天的吸光度值作為基準(zhǔn)，取每1 d的吸光度值與其的比值繪制生長(zhǎng)曲線。根據(jù)藥物濃度設(shè)為3 組，每孔加入10 μl Met，濃度分別為10、 100、1 000 nmol/L。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) BMMSCs消化計(jì)數(shù)后，按照1×104/皿的密度接種， 37 ℃， 5% CO2孵箱培養(yǎng)， 每4 d換液， 14 d時(shí)去除培養(yǎng)液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定后，0.2%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，后PBS清洗，拍照。

1.2.4 成骨分化 BMMSCs消化計(jì)數(shù)后，按照2×105/孔的密度接種于12孔板，待細(xì)胞融合到80%左右更換成成骨誘導(dǎo)液，每3 d換液，誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行ALP染色， 14 d后進(jìn)行茜素紅染色。

1.2.5 ALP染色 成骨誘導(dǎo)7 d后，去除誘導(dǎo)液，PBS清洗，加入配置好的ALP染色試劑，避光染色5～30 min，PBS清洗，拍照并使用Image J測(cè)定灰度值。

1.2.6 茜素紅染色 成骨誘導(dǎo)14 d后，去除誘導(dǎo)液，PBS清洗，異丙醇進(jìn)行固定，0.1%茜素紅染液進(jìn)行染色，PBS清洗，拍照并通過(guò)十六烷基丙磺酸鈉溶解后檢測(cè)吸光度值進(jìn)行定量。

1.2.7 ROS檢測(cè) BMMSCs按照4×105/孔的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞鋪滿率達(dá)到70%，使用ROS初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，倒置顯微鏡觀察。

1.2.8 RT-PCR檢測(cè) 應(yīng)用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA進(jìn)行濃度測(cè)定，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板在相應(yīng)基因的引物作用下進(jìn)行擴(kuò)增，使用ABI7500 RT-PCR儀(ABI公司， 美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表 1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

表 1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 P1和P6代BMMSCs增殖和成骨分化能力比較

P6代BMMSCs的生長(zhǎng)曲線明顯低于P1代細(xì)胞(P<0.05)(圖 1A)，表明P6代BMMSCs的增殖能力較低。克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖 1B、 1C)說(shuō)明P6代BMMSCs的克隆形成能力低于P1代細(xì)胞(P<0.05)。PCR結(jié)果(圖 1H、1I)顯示P6代BMMSCs的增殖相關(guān)基因Ccnd1和Ccne1表達(dá)水平顯著低于P1代細(xì)胞(P<0.05)。

成骨分化誘導(dǎo)后的ALP(圖 1D、 1E)和茜素紅染色(圖 1F、1G)結(jié)果表明，P6代BMMSCs的成骨分化能力明顯低于P1代細(xì)胞(P<0.05)。PCR結(jié)果(圖 1J、 1K)表明與P1代細(xì)胞相比，P6代BMMSCs的成骨相關(guān)基因OCN和Runx2的表達(dá)水平較低(P<0.05)。

圖 1 P1和P6代小鼠BMMSCs的增殖，克隆形成和成骨分化能力比較

2.2 Met對(duì)P6代BMMSCs增殖能力的影響

從生長(zhǎng)曲線(圖 2A)中可以看到，Met處理可以提高P6代BMMSCs的增殖能力，其中100 nmol/L濃度的提高作用最明顯(圖 2B、 2C)。100 nmol/L的Met可以顯著提高P6代BMMSCs的克隆形成能力(P<0.05)。圖 2D、 2E顯示Met處理可以增強(qiáng)P6代BMMSCs的增殖相關(guān)基因Ccnd1和Ccne1的表達(dá)水平(P<0.05)。

2.3 Met對(duì)P6代BMMSCs成骨分化能力的影響

ALP染色(圖 3A、 3B)和茜素紅染色(圖 3C、 3D)結(jié)果表明100 nmol/L Met提高了P6代BMMSCs的成骨分化能力(P<0.05)，PCR結(jié)果表明(圖 3E、 3F)Met可以提高P6代BMMSCs成骨相關(guān)基因OCN和Runx2的表達(dá)水平(P<0.05)。

2.4 Met對(duì)P6代BMMSCs氧化應(yīng)激和抗氧化能力的影響

ROS染色(圖 4A，4B)顯示P6代BMMSCs相對(duì)于P1代BMMSCs，ROS含量明顯升高，Met處理可以有效減少ROS的產(chǎn)生(P<0.05)?？寡趸嚓P(guān)基因Foxo1，F(xiàn)oxo3，Sod1和Sod2的PCR結(jié)果(圖 4C～4F)表明與P1代BMMSCs相比，P6代BMMSCs的抗氧化相關(guān)基因表達(dá)明顯降低，Met處理可以部分恢復(fù)其表達(dá)水平(P<0.05)。

2.5 Met對(duì)P6代BMMSCs干細(xì)胞屬性(干性)和衰老的影響

圖 2 Met對(duì)P6代小鼠BMMSCs增殖能力的作用

圖 3 Met對(duì)P6代小鼠BMMSCs成骨分化功能的作用

PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明P6代BMMSCs相對(duì)于P1代BMMSCs，干性相關(guān)基因Nanog、 Sox2、 C-myc和Klf4的表達(dá)水平明顯降低，Met處理可以顯著增加這些基因的表達(dá)水平(P<0.05)(圖 5A～5D)。P6代BMMSCs的衰老相關(guān)標(biāo)志基因p16和p53表達(dá)增高，且可以被Met降低(P<0.05)(圖 5E～5F)。

3 討 論

Met具有促進(jìn)BMMSCs成骨分化的功能[9]，并且具有減輕高血糖引起的氧化應(yīng)激對(duì)BMMSCs損傷的作用[10]。本研究中，首先驗(yàn)證了體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中小鼠來(lái)源BMMSCs的增殖和成骨分化功能降低。我們將不同濃度Met加入培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)Met可以增強(qiáng)P6代BMMSCs的增殖能力，且100 nmol/L的效果較50 nmol/L和1 000 nmol/L更明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Met可以增強(qiáng)P6代BMMSCs的克隆形成能力和成骨分化功能，提示Met可應(yīng)用于體外培養(yǎng)體系中以改善MSCs功能。

圖 4 Met對(duì)P6代小鼠BMMSCs的氧化應(yīng)激和抗氧化能力的作用

圖 5 Met對(duì)P6代小鼠BMMSCs的干性和衰老相關(guān)基因的作用

Fig 5 The effects of Met on the expression level of stemness and senescence genes of P6 mice BMMSCs

氧化應(yīng)激是體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞功能受損的重要因素[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，ROS產(chǎn)生過(guò)多引起氧化應(yīng)激，損害BMMSCs的增殖和成骨功能，促進(jìn)細(xì)胞衰老[12]； 降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，可以改善BMMSCs功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)Met可以降低長(zhǎng)期體外培養(yǎng)BMMSCs的氧化應(yīng)激水平，提高抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平，提示抑制氧化應(yīng)激可能是Met改善長(zhǎng)期培養(yǎng)BMMSCs增殖和成骨分化能力的一種機(jī)制； 進(jìn)一步檢測(cè)干性相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Met可以促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)水平，提示Met可能對(duì)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中BMMSCs的干性維持具有有利作用； 進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)Met可以降低體外長(zhǎng)期培養(yǎng)BMMSCs中衰老相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)水平。

綜上所述，Met可以有效改善體外長(zhǎng)期培養(yǎng)小鼠來(lái)源BMMSCs的增殖和成骨分化功能，提示可以將其作為優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)體系的手段，以促進(jìn)BMMSCs的體外擴(kuò)增和臨床應(yīng)用。