阿依居來克·卡得爾， 仇艷麗， 單 宇， 李欣榮， 唐 城， 孫媛媛， 高曉黎

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院； 2新疆特豐藥業(yè)股份有限公司， 烏魯木齊 830011)

復(fù)方甘草酸苷片(Compound Glycyrrhizin Tablets)是由甘草酸苷(Glycyrrhizin，GL)、甘氨酸(glycine，GLY)及DL-蛋氨酸(DL-methionine，MET)組成的復(fù)方制劑[1]。其中甘草酸苷又稱甘草甜素，是一種臨床使用的抗炎抗病毒的三萜類化合物[2-3]，在體內(nèi)被小腸細(xì)菌代謝為甘草次酸后吸收進入機體發(fā)揮藥理作用，具有抗過敏、免疫調(diào)節(jié)及抑制病毒增殖和對病毒滅活的作用。甘氨酸可調(diào)節(jié)腎功能，干擾 Na+、K+重吸收，防止由甘草酸引起的輕微偽醛固酮癥狀。DL-蛋氨酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，后者可提高肝臟的解毒能力，減少過敏反應(yīng)。

甘草酸苷在臨床上用于治療各種類型的肝病[4-8]，改善肝功能異常及治療各種皮膚病[9-14]。目前已在臨床中廣泛應(yīng)用。本實驗建立了高效液相色譜法(中國藥典2015年版通則0512)測定復(fù)方甘草酸苷片中甘草酸苷含量，并依據(jù)《方法驗證指導(dǎo)原則》對該方法進行了驗證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-20AD高效液相色譜儀(島津)，LC-2030D 3C高效液相色譜儀(島津)，CPA225D精密天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，BSA224S萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥復(fù)方甘草酸苷片(新疆特豐藥業(yè)股份有限公司，批號：20181027，20181123，20181206)，甘草酸銨(中國食品藥品檢定研究院，批號：110731-201619、110731-201720，含量為93.0%和97.7%)，乙腈為色譜級，其余冰乙酸、95%乙醇均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Kromasil 100A C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：2%醋酸-乙腈(65∶35)；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；運行時間：25 min。甘草酸苷峰理論塔板數(shù)不低于2 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 稱定甘草酸銨對照品12.5 mg置50 mL量瓶中，加50%的稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.25 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液 稱定供試品粉末0.170 g置100 mL量瓶中，用50%的稀乙醇溶解定容至刻度，即得。

2.2.3 陰性溶液 稱定空白輔料90 mg、甘氨酸和蛋氨酸分別25 mg，置100 mL量瓶中，加50%稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗取對照品溶液，按“2.2.1”項下方法測定，連續(xù)進樣6針，結(jié)果見表1。理論塔板數(shù)按甘草酸苷計算應(yīng)不低于2 000。結(jié)果表明，6針主峰峰面積RSD=0.1%，理論塔板數(shù)>2 000，拖尾因子<1.5，表明系統(tǒng)適用性良好，符合規(guī)定。

表1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

2.4 專屬性試驗

2.4.1 溶劑、輔料干擾試驗 取溶劑、陰性溶液、對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1?？芍什菟彳毡Ａ魰r間為11.3 min，溶劑和輔料對檢測無干擾。

A: 溶劑B: 陰性溶液

C:對照品溶液D:供試品溶液

圖1 溶劑、輔料干擾專屬性HPLC圖譜

2.4.2 強制降解試驗

2.4.2.1 強酸破壞 稱取供試品粉末0.170 g置100 mL量瓶中，加20 mL溶劑溶解，后加入1 moL/L鹽酸溶液1 mL，置室溫下18 h，加1 moL/L氫氧化鈉溶液1 mL中和，加稀乙醇稀釋至刻度，作為酸降解溶液，按“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

圖2 酸降解專屬性HPLC圖譜

2.4.2.2 強堿降解試驗 稱取供試品粉末約0.170 g置100 mL量瓶中，加20 mL溶劑溶解，后加入1 moL/L氫氧化鈉溶液2 mL，置80℃下4 d，取出放置室溫后加1 moL/L鹽酸溶液2 mL中和，加稀乙醇稀釋至刻度，作為堿降解溶液，按“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3。

圖3 堿降解專屬性HPLC圖譜

2.4.2.3 氧降解試驗 取供試品粉末0.170 g置100 mL量瓶中，加20 mL溶劑溶解，后加入3%H2O2溶液2 mL，置80℃下4 d，取出放置室溫后加稀乙醇稀釋至刻度，作為氧降解溶液，按“2.1”項下方法測定，結(jié)果見圖4。

圖4 氧降解專屬性HPLC圖譜

2.4.2.4 高溫降解試驗 稱定供試品粉末0.170 g置稱量瓶中，放置80℃高溫條件下28 d，取出放置室溫后，加稀乙醇稀釋轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，溶解定容至刻度，作為高溫降解溶液，按“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖5。

圖5 高溫降解專屬性HPLC圖譜

2.4.2.5 光照降解試驗 稱定供試品粉末0.170 g置稱量瓶中，放置光照(4 500±500)LUX條件下28 d，取出后，加溶劑稀釋轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解定容至刻度，作為光照降解溶液，按“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖6。

圖6 光照降解專屬性HPLC圖譜

2.4.2.6 專屬性試驗結(jié)論 專屬性試驗結(jié)果表明，溶劑、輔料及強制降解溶液不干擾甘草酸苷測定。該方法專屬性良好。

2.5 檢測限和定量限試驗取“2.2.1”項下對照品溶液進一步稀釋，分別量取20 μL進樣，得檢測限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10)。結(jié)果表明甘草酸苷的檢測限為0.082 μg/mL，定量限濃度為0.413 μg/mL，6針定量限主峰保留時間RSD<2.0%，峰面積RSD<5.0%，見表2。

表2 檢測限和定量限測定結(jié)果

2.6 線性關(guān)系考察稱取甘草酸銨對照品適量，分別配制成每1 mL分別含206.39、219.28、232.18、239.18、257.98、283.78、309.58 μg的系列對照品溶液，分別依法測定，結(jié)果見表3，以甘草酸苷峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)。甘草酸苷線性方程為Y=16 331.86X+3 053.83，r=0.999 2，表明甘草酸苷在206.39～309.58 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

表3 線性測定結(jié)果

2.7 精密度試驗取同一批樣品按照“2.2.2”項下方法制備6份供試品，按“2.1”項下方法測定重復(fù)性。取同一樣品，在另一臺HPLC儀上由另一操作人員，于不同日期同法測定中間精密度。結(jié)果見表4，結(jié)果表明重復(fù)性6次測定結(jié)果RSD≤2.0%，中間精密度12次測定結(jié)果RSD≤5.0%，重復(fù)性和中間精密度符合要求。

表4 精密度試驗結(jié)果

2.8 回收率試驗取空白輔料90 mg，共9份，按照處方比例加入低、中、高不同量的甘草酸單銨鹽原料藥分別置裝有、甘氨酸和蛋氨酸分別為25 mg的100 mL量瓶中，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下方法測定，按外標(biāo)一點法以峰面積計算含量，并計算回收率。結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，單一回收率和平均回收率為98.0%～102.0%，RSD為0.6%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗取“2.2.2”項下的供試品溶液，分別于0、14、24、48 h進樣分析。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置48 h，含量無顯著變化，RSD為0.4%，RSD<2.0%，表明供試品溶液室溫放置48 h穩(wěn)定,見表 6。

表5 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

表6 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.10 耐用性試驗取“2.2.2”項下的供試品溶液，按“2.1”項下方法測定，于不同流速、柱溫及有機相比例(表7)測定甘草酸苷含量。在試驗流速、柱溫、流動相比例變化下，甘草酸苷含量變化RSD<2.0%，表明該方法耐用性符合要求，結(jié)果見表8。

表7 色譜條件變動的參數(shù)

表8 耐用性試驗結(jié)果

2.11 樣品含量測定取3批復(fù)方甘草酸苷片樣品按“2.1”項下方法測定含量，結(jié)果表明3批樣品含量均符合規(guī)定，結(jié)果見表9。

表9 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

復(fù)方甘草酸苷片為臨床常用藥物。本研究按照(中國藥典 2010 年版二部附錄Ⅴ D)對復(fù)方甘草酸苷片中甘草酸苷含量測定并對方法進行考察。為提高本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，控制復(fù)方甘草酸苷片的質(zhì)量。

方法驗證對含量測定方法的專屬性、系統(tǒng)適用性、線性范圍、回收率、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性、耐用性等各方面進行了考察，發(fā)現(xiàn)該方法專屬性好，準(zhǔn)確度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用性強，均符合規(guī)定。