郭潔兒，鄧潔瑩，駱雨雨，張淑晶，李 云

（韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院，廣東潮州 521041）

γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，GABA） 是一種經(jīng)谷氨酸脫羧酶 （Glutamatedecarboxylase，GAD） 催化L-谷氨酸 （L-glutamic acid） 脫羧生成的天然非蛋白質(zhì)氨基酸[1]。作為一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。越來越多的研究表明，GABA具有很多對(duì)人類健康有益的生理功能，包括抗高血壓、鎮(zhèn)靜、抗糖尿病、抗肥胖和抗癌等[2]。

制備GABA的方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法兩大類。化學(xué)合成法不適合制備作為食品功能添加劑的GABA，因?yàn)榛瘜W(xué)合成過程中使用的有毒化學(xué)品可能殘留在最終產(chǎn)品中[3]。生物合成法是利用具有GAD活性的微生物合成GABA，與化學(xué)合成法相比，生物合成方法更容易實(shí)施，有更好的安全性，并且能在高選擇性和更少的副產(chǎn)物條件下獲得產(chǎn)生理想的產(chǎn)量。生物合成法包括微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法2種。利用微生物（特別是GAD活性高的乳酸菌）的細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化是大規(guī)模GABA生產(chǎn)的一種很有前途的技術(shù)，具有反應(yīng)時(shí)間短、工藝簡(jiǎn)單、后續(xù)分離純化容易等優(yōu)勢(shì)，近年來受到了廣泛的關(guān)注。微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，先通過培養(yǎng)細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液后離心去掉培養(yǎng)基，再制備菌懸液與底物等反應(yīng)，簡(jiǎn)化了反應(yīng)體系，有利于下游GABA的分離純化。目前，利用乳酸菌生物轉(zhuǎn)化制備GABA已有報(bào)道，采用的菌種有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）[4]、短乳桿菌 （Lactobacillus brevis）[5]和嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）[6]等。植物乳桿菌（L.plantarum） 是一種食品級(jí)安全的乳酸菌菌株，利用植物乳桿菌制備GABA，是比較安全、理想的途徑。試驗(yàn)以從發(fā)酵食品中分離的1株高GAD活性的植物乳桿菌P48作為菌種，研究了P48細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化法制備GABA的特性。通過在不同pH值、溫度、底物濃度和產(chǎn)物濃度的條件下進(jìn)行反應(yīng)，探究反應(yīng)的最佳條件，使得轉(zhuǎn)化液中的GABA中產(chǎn)量達(dá)到最高，將為植物乳桿菌P48在大規(guī)模轉(zhuǎn)化制備GABA提供有效的試驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

γ-氨基丁酸（純度99.5%）、谷氨酸—鈉鹽（L-MSG純度為99.5%），配制培養(yǎng)基用胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉為生化試劑，其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 菌種和培養(yǎng)基

1.2.1 菌種

分離于自然發(fā)酵酸菜，由發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2.2 培養(yǎng)基

改良PSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉0.83 g，吐溫1 g，L-MSG 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 6.8～7.0，于121℃條件下滅菌20 min。用于培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化用細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與菌懸液的制備

取保藏菌種，按1%接種量接種于含有6 mL的PSB培養(yǎng)液的試管中，于37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。活化后，將菌種按1%接種量再接入30 mL的PSB培養(yǎng)液的三角瓶中，制得種子培養(yǎng)液。按照2%的接種量，接種于200 mL的PSB液體培養(yǎng)基，于37℃條件下靜置培養(yǎng)。

每100mL發(fā)酵液于4℃條件下，以轉(zhuǎn)速10000r/min離心10 min，用10 mL的生理鹽水洗滌菌體2次，然后再加10 mL生理鹽水制成菌懸液。所得菌懸液，平均分為2組，一組用作細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)；另一組在冰浴條件下超聲波破碎20 min（每次5 s工作，10 s間歇），破碎后在4℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液用作粗酶液。

1.3.2 不同pH值對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化活性的影響

L-MSG溶解于0.4 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，分別配制成pH值分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的200 mmol/L L-谷氨酸—鈉底物溶液。分別加入菌懸液和粗酶液進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積4 mL，含2 mL蒸餾水、1 mL菌懸液（或粗酶液）和1 mL底物溶液。置于37℃水浴中反應(yīng)，5 h后取樣。

1.3.3 不同溫度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化活性的影響

在底物溶液濃度為200 mmol/L，于pH值4.5條件下進(jìn)行細(xì)胞和粗酶液反應(yīng)，分別置于25，30，35，40，45，50℃的條件下反應(yīng)5 h后取樣。

1.3.4 不同底物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化活性的影響

在溫度40℃，pH值4.5的條件下，分別采用25，50，75，100，150 mmol/L的初始底物濃度進(jìn)行細(xì)胞和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)5 h后取樣。

1.3.5 不同產(chǎn)物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化活性的影響

在初始反應(yīng)體系中加入不同量的GABA，使GABA初始濃度分別為5，10，20，40，60，80 mmol/L。按上述試驗(yàn)所得最佳條件，分別進(jìn)行細(xì)胞和粗酶液反應(yīng)，轉(zhuǎn)化5 h后取樣。

1.3.6 GABA含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]采用高效液相色譜法對(duì)轉(zhuǎn)化液中的GABA進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)活性的影響

在不同的pH值條件下分別測(cè)定P48細(xì)胞菌懸液及其粗酶液轉(zhuǎn)化反應(yīng)所得的GABA含量。

pH值對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶液活性的影響見圖1。

圖1 pH值對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶液活性的影響

由圖1可知，在使用粗酶液的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，P48粗酶的最適pH值為5.0。而在P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，pH值3.5～4.0時(shí)的GABA產(chǎn)量快速上升；在pH值4.0～5.5，雖然其產(chǎn)量有下降，但下降較為緩慢；pH值達(dá)到6.0時(shí)，其GABA的產(chǎn)量仍保持在60%，因此P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適pH值為4.0。對(duì)比2組曲線，在各自反應(yīng)的最適pH值條件下，采用粗酶液轉(zhuǎn)化的GABA產(chǎn)量比采用細(xì)胞的高。由于GAD是胞內(nèi)酶，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備GABA時(shí)，底物需通過運(yùn)送蛋白（Antiporter）運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，在胞質(zhì)經(jīng)GAD發(fā)生脫羧反應(yīng)生成GABA，生成的GABA再由運(yùn)送蛋白運(yùn)送出細(xì)胞外[5]。細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程在一定程度上受底物和產(chǎn)物傳質(zhì)阻力的影響，而粗酶液組中的GAD可直接與體系中的底物反應(yīng)，因此采用粗酶液的GABA產(chǎn)量較細(xì)胞轉(zhuǎn)化高。從維持高酶活的pH值范圍來看，細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH值4.0～5.5時(shí)，GABA的產(chǎn)量相差不大，而粗酶液組在pH值高于或低于5.0，GABA的產(chǎn)量都急劇下降，可見P48細(xì)胞菌懸液組適應(yīng)的pH范圍更寬廣。當(dāng)外界環(huán)境的pH值發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的pH值仍能維持一定的生理平衡，因此胞內(nèi)GAD的活性受pH值的影響較低。而粗酶液的GAD經(jīng)細(xì)胞破碎后釋放到胞外，失去了細(xì)胞的保護(hù)，對(duì)pH值的變化較為敏感。P48細(xì)胞適應(yīng)pH值范圍更寬，有利于生產(chǎn)條件的調(diào)控，更適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

2.2 溫度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

溫度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響見圖2。

圖2 溫度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

由圖2可知，P48粗酶轉(zhuǎn)化的最適溫度為40℃。P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的GABA產(chǎn)量在25～45℃時(shí)不斷增長(zhǎng)，溫度超過45℃后，其產(chǎn)量有所降低，但降低幅度不大。50℃時(shí)，產(chǎn)量仍保持70%左右，所以P48細(xì)胞菌懸液組的反應(yīng)最適溫度為45℃。對(duì)比2組曲線，溫度高于或低于40℃時(shí)，使用粗酶的反應(yīng)GABA產(chǎn)量都下降很快，溫度達(dá)到50℃時(shí)，轉(zhuǎn)化液中的GABA產(chǎn)量降到了40%，采用粗酶反應(yīng)對(duì)溫度較敏感，受溫度的影響大。而在細(xì)胞反應(yīng)中40～50℃時(shí)，GABA的產(chǎn)量差異不大，溫度達(dá)到50℃時(shí)，產(chǎn)量仍有70%。由此可見，采用細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)有更寬的溫度耐受范圍。從已有文獻(xiàn)看，龔福明等人[8]報(bào)道植物乳桿菌YM-4-3發(fā)酵法制備GABA的最佳溫度為35℃，李理[9]研究了植物乳桿菌ATCC14917發(fā)酵制備GABA的最佳溫度為40℃，渠巖等人[10]對(duì)研究了醬油后酵中植物乳桿菌S35發(fā)酵產(chǎn)GABA的條件，報(bào)道其最佳反應(yīng)溫度為35℃。試驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌P48轉(zhuǎn)化制備GABA最適溫度45℃比上述的植物乳桿菌菌株的略高，說明P48在轉(zhuǎn)化過程中的GAD活性能耐受較高溫度，可以在較高溫度條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在一定程度上可以抑制轉(zhuǎn)化體系中常見的雜菌生長(zhǎng)，更有利于實(shí)際的大規(guī)模生產(chǎn)。

2.3 底物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

底物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響見圖3。

圖3 底物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5～50 mmol/L時(shí)，粗酶轉(zhuǎn)化液中的GABA產(chǎn)量隨底物濃度的增大而增加較快，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0 mmol/L后，GABA的產(chǎn)量隨底物濃度增大而減少，底物濃度達(dá)到150 mmol/L時(shí)，GABA降低到了60%以下，因此P48粗酶液的最佳反應(yīng)底物濃度為50 mmol/L。在P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)在底物濃度為25～100 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化液中的GABA含量亦隨著底物濃度增大而增大。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?00 mmol/L后，GABA產(chǎn)量開始下降，但下降速度緩慢，底物濃度為150 mmol/L時(shí)，GABA產(chǎn)量仍有80%，所以P48細(xì)胞反應(yīng)的最適底物濃度為100 mmol/L。對(duì)比2組曲線，2組的最高產(chǎn)量相差不大。但2組最適底物濃度不一樣，而且細(xì)胞反應(yīng)組在底物濃度75～150 mmol/L時(shí)產(chǎn)量仍保持80%。而粗酶反應(yīng)組的GABA產(chǎn)量一直呈下降趨勢(shì)。底物濃度過高時(shí)對(duì)酶有抑制作用，過量的底物分子可作為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。當(dāng)粗酶液的底物濃度達(dá)到體系最大承受容量時(shí)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)會(huì)受到抑制作用。而細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)中由于細(xì)胞的保護(hù)作用，限制了底物的進(jìn)入量，從而減低了底物對(duì)GAD的抑制，細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的GAD酶活受底物抑制程度較低。因此，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備GABA，可以用更高濃度的底物，減少投料次數(shù)，省時(shí)省力并且可以減少生產(chǎn)成本，更適合用于大規(guī)模生產(chǎn)GABA。

2.4 產(chǎn)物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

產(chǎn)物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響見圖4。

GABA的初始濃度為0～20 mmol/L時(shí)，粗酶轉(zhuǎn)化液中的GABA逐漸增加，當(dāng)GABA的濃度大于20 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化液中的GABA產(chǎn)量明顯下降，所以粗酶液轉(zhuǎn)化反應(yīng)最適底物濃度為20 mmol/L。而P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化組，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥诨蛐∮?0 mmol/L時(shí)，其轉(zhuǎn)化液中的GABA的產(chǎn)量都下降，所以其最適產(chǎn)物濃度也為20 mmol/L?？梢姷蜐舛鹊漠a(chǎn)物有利于進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。但是，當(dāng)產(chǎn)物的量過高，反應(yīng)體系達(dá)到飽和狀態(tài)，反應(yīng)速度會(huì)減緩甚至可能出現(xiàn)停止的情況。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物濃度在20～40 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化液中的GABA產(chǎn)量開始下降，但是細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)組下降速度較緩慢。當(dāng)體系的產(chǎn)物濃度逐漸增大，反應(yīng)易出現(xiàn)反饋抑制。過多的產(chǎn)物分子可作為變構(gòu)劑抑制GAD的活性，從而使得新生成的GABA含量減少。未加入GABA前，粗酶轉(zhuǎn)化液中的GABA含量比細(xì)胞菌懸液組要高，導(dǎo)致粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)受產(chǎn)物的抑制作用較大，而細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)中由于細(xì)胞的保護(hù)作用使得轉(zhuǎn)化反應(yīng)受產(chǎn)物濃度影響較小。由以上分析可知，P48菌懸液適合用于大規(guī)模生產(chǎn)GABA，轉(zhuǎn)化體系可以容納更高濃度的產(chǎn)物。

圖4 產(chǎn)物濃度對(duì)P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化和粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

3 結(jié)論

采用植物乳桿菌P48細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化制備GABA，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適pH值為4.0，最適反應(yīng)溫度45℃，加入的底物濃度100 mmol/L，加入的底物量較高，當(dāng)產(chǎn)物濃度大于20 mmol/L時(shí)有產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。試驗(yàn)得到的P48細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件，可在溫度較高條件下進(jìn)行反應(yīng)，有利于大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)減少雜菌污染的影響；P48轉(zhuǎn)化反應(yīng)能采用較高的起始底物濃度，有利用利于減少投料次數(shù)，降低生產(chǎn)成本，利于促進(jìn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，增加GABA的產(chǎn)量。這為利用植物乳桿菌P48細(xì)胞大規(guī)模轉(zhuǎn)化制備GABA提供了實(shí)際的參考數(shù)據(jù)。