烏 素，班 瑞，楊曉艷，李少英

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli），又稱大腸桿菌，是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌屬 （Escherichia） 的代表菌。因Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)而得名[1]，因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、繁殖速度快、分布廣等特點(diǎn)，無論在科學(xué)試驗(yàn)研究中，還是在食品安全和相關(guān)疾病研究中，常作為載體菌、指示菌、病原菌備受廣大科研工作者的關(guān)注[2]。如何快速檢測(cè)樣品中的大腸桿菌是研究者幾十年來一直亟待解決的問題，特別是大腸桿菌生長(zhǎng)過程中的形態(tài)、染色特性等基本內(nèi)容[1]。試驗(yàn)通過革蘭氏染色的方法，對(duì)培養(yǎng)8～24 h大腸桿菌的形態(tài)特征進(jìn)行研究，對(duì)今后更好地控制和利用大腸桿菌，具有指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：Escherichia coli ATCC：25922（大腸桿菌），購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，以下命名為E.coli-1。

試驗(yàn)菌株：來自于實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，以下命名為E.coli-2。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；CP522C型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；WPL-230BE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BBS-SDC型潔凈工作臺(tái)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；GR60DA型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司產(chǎn)品；DM500+ICC50Leica型顯微鏡，德國(guó)徠卡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)藥品

革蘭氏染色液，南京建成生物工程研究所提供；胰蛋白胨（生化試劑），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；酵母提取粉（生化試劑），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；瓊脂（生化試劑），天津市英博生化試劑有限公司提供；氯化鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基的調(diào)配

①LB液體培養(yǎng)基的配制。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌均勻，調(diào)pH值為7.4。②LB固體培養(yǎng)基的配制。將LB液體培養(yǎng)基調(diào)pH值后，再加入瓊脂15 g，加熱、攪拌至沸騰。將配置好的LB液體培養(yǎng)基分裝到試管中，固體培養(yǎng)基分裝到錐形瓶?jī)?nèi)，于121℃滅菌20 min[3]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化與保藏

將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，如此再重復(fù)2次，穿刺保藏于LB半固體培養(yǎng)基中，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，于4℃保藏不同時(shí)間，備用。

1.2.2 不同生長(zhǎng)階段形態(tài)的研究

分別對(duì)培養(yǎng)8～24 h的大腸桿菌進(jìn)行涂片染色，中間每2 h涂1次片，觀察形態(tài)并記錄。

1.2.3 供試菌液制備

將保藏的大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，活化到三代，于37℃下恒溫培養(yǎng)24h，以轉(zhuǎn)速3000r/min離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌（每次5 mL，反復(fù)離心洗滌3次），即得供試菌液[4]。

1.2.4 涂片的制備、干燥與固定

（1）涂片。采用傳統(tǒng)常規(guī)涂菌[4]。試驗(yàn)將待觀察的大腸桿菌培養(yǎng)8～24 h，每隔2 h從37℃恒溫箱中取出1試管的菌液進(jìn)行離心（以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min），然后將離心好的菌泥在超凈臺(tái)中用接種環(huán)從離心管中挑起滿環(huán)或者半環(huán)進(jìn)行涂片。

（2）干燥。將涂片放到滅菌的超凈臺(tái)中，于室溫下進(jìn)行干燥[4]。

（3）固定。采用火焰固定法。

1.2.5 革蘭氏染色

初染（草酸銨結(jié)晶紫） 設(shè)定了1，2，3 min；媒染（革蘭氏碘液） 1 min；脫色（95%的乙醇） 設(shè)定了30 s和1，2，3 min；復(fù)染（番紅染色液） 1 min。步驟采用傳統(tǒng)染色法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間大腸桿菌形態(tài)特征

將大腸桿菌活化2代，將第3代菌分別培養(yǎng)8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，并分別對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色，用油鏡（100×）進(jìn)行觀察。

大腸桿菌E.coli-1，E.coli-2培養(yǎng)8～24 h的形態(tài)特征見表1。

由表1可知，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的四步革蘭氏染色法對(duì)菌體進(jìn)行涂片染色后，大腸桿菌都呈現(xiàn)紅色。其中培養(yǎng)8～16 h的大腸桿菌呈現(xiàn)短桿狀比較明顯，到了18～24 h大腸桿菌的形態(tài)變得無規(guī)則。這是因?yàn)榧?xì)菌在適宜的培養(yǎng)條件下，一般十幾個(gè)小時(shí)即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。如果菌齡過長(zhǎng)，菌體會(huì)出現(xiàn)異常形態(tài)[6]。

表1 大腸桿菌E.coli-1，E.coli-2培養(yǎng)8～24 h的形態(tài)特征

2.2 草酸銨結(jié)晶紫初染時(shí)間對(duì)大腸桿菌形態(tài)觀察的影響

用草酸銨結(jié)晶紫對(duì)培養(yǎng)16 h的大腸桿菌E.coli-1進(jìn)行染色1～3 min，每種情況涂片10張。

草酸銨結(jié)晶紫染色1 min見圖1，草酸銨結(jié)晶紫染色2 min見圖2，草酸銨結(jié)晶紫染色3 min見圖3。

圖1 草酸銨結(jié)晶紫染色1 min

由圖1～圖3可知，草酸銨結(jié)晶紫對(duì)大腸桿菌染色1～3 min的染色效果是相同的，所以在染色時(shí)采用草酸銨結(jié)晶紫染色1 min，可以節(jié)省染色所消耗的時(shí)間。

2.3 酒精脫色時(shí)間對(duì)大腸桿菌形態(tài)觀察的影響

用培養(yǎng)16 h的大腸桿菌E.coli-1涂片分別進(jìn)行1，2，3 min不同脫色時(shí)間試驗(yàn)，每種情況涂片10張。

脫色1 min見圖4，脫色2 min見圖5，脫色3 min見圖6。

由圖4～圖6可知，由于涂片時(shí)涂菌厚度較一般涂片厚，因此在酒精脫色的過程中時(shí)間從30 s延長(zhǎng)至1，2，3 min進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，酒精脫色3 min時(shí)觀察效果最佳，所以其余涂片染色時(shí)都把酒精脫色延長(zhǎng)至3 min。同時(shí)應(yīng)減少取菌量，降低細(xì)菌堆積密度，以防涂片菌膜濃厚時(shí)會(huì)因大腸桿菌密集成堆而不易脫色或脫色不完全，呈現(xiàn)假陽性反應(yīng)[7-9]；而如果涂片太薄、大腸桿菌數(shù)量太少，觀察時(shí)難以尋找到合適視野[10]，所以涂片厚度也應(yīng)該保持適中。

圖2 草酸銨結(jié)晶紫染色2 min

圖3 草酸銨結(jié)晶紫染色3 min

圖4 脫色1 min

圖5 脫色2 min

圖6 脫色3 min

2.4 番紅復(fù)染時(shí)間對(duì)大腸桿菌形態(tài)觀察的影響

用培養(yǎng)16 h的大腸桿菌E.coli-1涂片分別進(jìn)行復(fù)染1，2，3 min試驗(yàn)，每種情況涂片10張。

番紅染色1 min見圖7，番紅染色2 min見圖8，番紅染色3 min見圖9。

圖7 番紅染色1 min

圖8 番紅染色2 min

圖9 番紅染色3 min

由圖7～圖9可知，當(dāng)番紅對(duì)大腸桿菌進(jìn)行1～3 min染色時(shí)，其染色效果相同，所以在給大腸桿菌進(jìn)行番紅染色時(shí)，選擇染色1 min，這樣既可以對(duì)大腸桿菌進(jìn)行染色觀察，又縮短了對(duì)大腸桿菌的整體染色時(shí)間。

3 結(jié)論

大腸桿菌在培養(yǎng)8～16 h時(shí)，形態(tài)特征表現(xiàn)明顯，呈現(xiàn)短桿狀；到了18～24 h形態(tài)變得無規(guī)則。草酸銨結(jié)晶紫初染和番紅復(fù)染對(duì)革蘭氏染色結(jié)果影響較小，乙醇脫色時(shí)間對(duì)革蘭氏染色結(jié)果有較大影響，在對(duì)菌體染色過程中，應(yīng)注意控制好菌齡和脫色時(shí)間[11-12]，才能得到正確的染色結(jié)果，以便于正確區(qū)分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，進(jìn)而可幫助臨床對(duì)食物中毒原因及所用藥物做出正確選擇[5]。