蔣美萍， 陳 蕊， 劉培晶， 嚴(yán)金川

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是一種病因復(fù)雜的肺血管疾病，以肺外周小血管重塑、閉塞，肺血管阻力進(jìn)行性增加為特征，最終形成右心室肥大和右心衰竭。肺動(dòng)脈高壓的病理特征表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和外膜成纖維細(xì)胞的過度增殖和凋亡耐受，導(dǎo)致肺血管管壁不斷增厚，肺血管重塑[1]。內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是肺動(dòng)脈高壓的重要啟動(dòng)因素[2]。

細(xì)胞在氧氣充足條件下的能量供應(yīng)仍主要依賴效率較低的糖酵解途徑，并產(chǎn)生大量乳酸，為細(xì)胞增殖合成DNA等提供大量底物，這一現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”，即有氧糖酵解[3]。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(pulmanory artery endothelial cells，PAECs)的類腫瘤細(xì)胞增殖與其葡萄糖能量代謝異常密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞有氧糖酵解增加，線粒體氧化磷酸化減少及乳酸產(chǎn)量增加。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體氧化磷酸化的抑制直接導(dǎo)致了線粒體依賴的凋亡，繼而上調(diào)糖酵解從而促進(jìn)了細(xì)胞促增殖表型。在PH模型動(dòng)物中應(yīng)用糖代謝調(diào)節(jié)藥物二氯乙酸鹽(dichloroacetate，DCA)可減輕肺血管重構(gòu)，緩解PH[4]。因此，PAECs葡萄糖能量代謝異?？赡苁荘H肺血管重構(gòu)的重要病理機(jī)制之一。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的異?；罨?、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)的突變及陷窩蛋白1(caveolin-1)的缺失均可抑制線粒體的氧化磷酸化，促進(jìn)PAECs有氧糖酵解過程[5]。然而，引起PAECs有氧糖酵解增強(qiáng)的原因及具體機(jī)制目前仍不清楚。

CD137是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族成員，主要表達(dá)在活化的免疫細(xì)胞表面，在炎癥刺激下也可表達(dá)于平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[6]。細(xì)胞表面CD137與其配體CD137L結(jié)合后激活CD137-CD137L信號(hào)(CD137信號(hào))，參與機(jī)體免疫炎癥、心血管疾病及腫瘤的發(fā)生[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，激活的CD137信號(hào)能夠促進(jìn)CD8+T細(xì)胞有氧糖酵解，進(jìn)而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[9]，這提示CD137信號(hào)可能通過介導(dǎo)細(xì)胞有氧糖酵解代謝，調(diào)控細(xì)胞增殖；然而，CD137信號(hào)是否參與肺高壓內(nèi)皮細(xì)胞增殖、異常代謝等功能障礙目前尚不清楚。本研究以小鼠PAECs為研究對(duì)象，探討CD137信號(hào)是否通過調(diào)控有氧糖酵解途徑影響小鼠PAECs增殖。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院。DMEM高糖培養(yǎng)基購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；胰酶和胎牛血清購自Gibco；CD137L重組蛋白購自生工生物科技有限公司；TNF-α購自PeproTech；2-脫氧葡萄糖(2-dexyglucose,2-DG)、內(nèi)皮素1(endothelin-1, ET-1)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)購自Sigma；己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)試劑盒和6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，PFK)試劑盒購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒及乳酸含量檢測(cè)試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗CD137、HK2、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-diphosphatase 3,PFKFB3)和c-Myc抗體購自Abcam；抗β-actin抗體購自康為公司；c-Myc抑制劑10074-G5購自TargetMol。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠PAECs，待細(xì)胞融合至60%進(jìn)行干預(yù)。將細(xì)胞分組如下：(1)空白對(duì)照(control)、同型對(duì)照(isotype control)組(不加任何刺激，待收集離心后與CD137同型抗體避光孵育30 min)、TNF-α刺激組(終濃度10 μg/L)、ET-1刺激組(終濃度10 mmol/L)和5-HT刺激組(終濃度1 μmol/L)，均刺激細(xì)胞24 h。(2)待細(xì)胞融合至60%，加入炎癥因子TNF-α(終濃度10 μg/L)刺激24 h后(誘導(dǎo)刺激細(xì)胞表達(dá)CD137)，分為對(duì)照組、CD137激動(dòng)劑(CD137 agonist)組[加入CD137L重組蛋白(終濃度5 mg/L，激動(dòng)CD137-CD137L信號(hào))]、c-Myc抑制劑組[予c-Myc抑制劑10074-G5(DMSO溶解，終濃度10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min后，再加入CD137L重組蛋白(終濃度5 mg/L)]和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)組[加入與c-Myc抑制劑組等量DMSO預(yù)處理細(xì)胞30 min，再加入CD137L重組蛋白(終濃度5 mg/L)；主要觀察溶解c-Myc抑制劑10074-G5的DMSO是否對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響]。(3)待細(xì)胞融合至60%后進(jìn)行干預(yù)，加入炎癥因子TNF-α(終濃度10 μg/L)刺激24 h后分為對(duì)照組、CD137激動(dòng)劑組[加入CD137L重組蛋白(終濃度5 mg/L，激動(dòng)CD137-CD137L信號(hào))]和2-DG組[予糖酵解抑制劑2-DG(雙蒸水溶解，終濃度10 mmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min后，再加入CD137L重組蛋白(終濃度5 mg/L)]。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PAECs膜表面CD137蛋白的表達(dá)水平 收集TNF-α(10 μg/L)、ET-1(10 mmol/L)和5-HT(1 μmol/L)刺激24 h后的PAECs，胰酶消化后收集細(xì)胞，離心去上清，然后以磷酸鹽緩沖液洗滌，分別與藻紅蛋白(P-phycoerythrin, PE)標(biāo)記的CD137抗體(0.3 μL, 1×106個(gè)細(xì)胞)及同型抗體室溫避光孵育30 min，篩網(wǎng)過濾后，取細(xì)胞懸液用AccuriTMC6型流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型分析，熒光信號(hào)強(qiáng)度代表PAECs膜表面CD137蛋白的表達(dá)水平。

2.3 Western blot檢測(cè)各組PAECs中CD137總蛋白及糖酵解酶的蛋白水平 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解1 h，4 ℃、15 000×g離心15 min，收集上清，100 ℃變性8 min。取等量蛋白樣本，10% SDS-PAGE分離蛋白后，以350 mA恒流90 min轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜。將膜置于5%脫脂奶粉的TBST(NaCl+KCl+Tris+Tween-20，pH 7.4)室溫封閉1 h。再分別用相應(yīng)的兔抗小鼠CD137(11 000)、HK2(11 000)、PFKFB3(11 000)、c-Myc(11 000)及β-actin(11 000)抗體,4 ℃孵育過夜;次日用TBST洗滌3次，每次15 min, 采用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(15 000)和山羊抗鼠(15 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，運(yùn)用LANE-1D軟件掃描條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值比值，即為各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞乳酸含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組葡萄糖及乳酸水平 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞至離心管內(nèi)，離心后棄上清，每500 萬細(xì)胞加入 1 mL蒸餾水，超聲波破碎細(xì)胞(冰浴，功率 20%，超聲 3 s，間隔 10 s，重復(fù) 30 次)，95 ℃水浴 10 min(蓋緊，防止水分散失)，冷卻后，8 000×g，25 ℃離心 10 min，取上清液備用，按加樣表加樣后于505 nm處測(cè)吸光度(A)值，根據(jù)公式計(jì)算出各組細(xì)胞葡萄糖水平。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞至離心管內(nèi)，離心后棄上清，每500萬細(xì)胞加入1 mL提取液一)，冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300 W，超聲3 s，間隔7 s，總時(shí)間3 min)，于4 ℃、12 000×g離心10 min，取0.8 mL上清液，加入0.12 mL提取液二，12 000×g離心10 min后取上清待測(cè)，按加樣表加樣后于570 nm處檢測(cè)各組吸光值，根據(jù)公式計(jì)算各組乳酸水平。

2.5 HK2試劑盒和PFK試劑盒檢測(cè)糖酵解酶活性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞至離心管內(nèi)，離心后棄上清，每500萬細(xì)胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞(冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次)，8 000×g、4 ℃離心10 min，取上清冰上待測(cè)，按照試劑盒加樣表加樣后于340 nm處檢測(cè)各組吸光度(A)值。根據(jù)公式計(jì)算各組HK2和PFKFB3酶活性。

2.6 CCK-8 試劑盒檢測(cè)PAECs的活力 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將胰酶消化的PAECs接種于96孔板，每孔約2 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后換含有0.1%血清培養(yǎng)基同步化1 d，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期，進(jìn)行相應(yīng)藥物干預(yù)；停止細(xì)胞干預(yù)，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，不要在孔中生成氣泡，將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值。

2.7 EdU法檢測(cè)PAECs增殖 將上述2.1(3)各組PAECs換無血清培養(yǎng)基同步化2 h，加入EdU工作液至終濃度為10 μmol/L，37 ℃孵育2 h，孵育完成后吸盡DMEM，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，吸盡固定液，3% BSA清洗3遍，加入1 mL 0.3% Triton X-100，室溫孵育15 min，吸盡通透液，用3% BSA清洗3遍，加入反應(yīng)體系(1× click reaction buf-fer 430 μL，CuSO420 μL，Azide 555 1 μL，click additive solution 50 μL)，室溫避光孵育30 min，吸盡反應(yīng)體系，用3% BSA清洗3遍，加入110稀釋的DAPI染液。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間多重比較采用Bonferroni-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CD137在活化的小鼠PAECs中表達(dá)增加

流式細(xì)胞術(shù)顯示，TNF-α、ET-1和5-HT刺激24 h后， 內(nèi)皮細(xì)胞CD137的熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1A。Western blot結(jié)果示，與對(duì)照組相比，TNF-α、ET-1和5-HT刺激24 h后，內(nèi)皮細(xì)胞CD137總蛋白水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1. The expression of CD137 was increased in activated PAECs. The membrane CD137 (A) and total CD137 (B) were increased after stimulated with TNF-α, ET-1 and 5-HT. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖1 CD137在活化的PAECs表達(dá)增加

2 激活CD137信號(hào)后，小鼠PAECs有氧糖酵解水平增加

乳酸檢測(cè)結(jié)果顯示，CD137激動(dòng)劑組乳酸產(chǎn)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2A。葡萄糖檢測(cè)結(jié)果示，CD137激動(dòng)劑組葡萄糖消耗明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2B。

糖酵解酶活性顯示，CD137激動(dòng)劑組糖酵解酶HK2和PFKFB3酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2C。Western blot結(jié)果顯示，CD137激動(dòng)劑組糖酵解酶HK2和PFKFB3蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖2D。

3 CD137信號(hào)通過c-Myc調(diào)控有氧糖酵解

c-Myc與細(xì)胞代謝改變和細(xì)胞增殖有著明確聯(lián)系。Western blot結(jié)果顯示,CD137激動(dòng)劑組c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖3A。預(yù)孵c-Myc特異性抑制劑10074-G5后，糖酵解酶HK2和PFKFB3酶活性較CD137激動(dòng)劑組顯著下降(P<0.05)，見圖3B。預(yù)孵c-Myc特異性抑制劑10074-G5后，糖酵解酶HK2和PFKFB3蛋白表達(dá)水平明顯低于CD137激動(dòng)劑組(P<0.05)，見圖3C。 DMSO組HK2和PFKFB3酶活性及蛋白表達(dá)水平與CD137激動(dòng)劑組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 2. The aerobic glycolysis level was up-regulated in mouse PAECs after activation of CD137 signaling. A: lactate production; B: glucose consumption; C: the enzyme activity of HK2 and PFKFB3; D: the protein expression of HK2 and PFKFB3. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖2 激活CD137信號(hào)后，小鼠PAECs有氧糖酵解水平增加

Figure 3. CD137 signaling regulated aerobic glycolysis by up-regulation of c-Myc. A: the expression of c-Myc; B: the enzyme activity of HK2 and PFKFB3; C: the protein expression of HK2 and PFKFB3. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsCD137 agonist group.

圖3 CD137信號(hào)通過c-Myc調(diào)控有氧糖酵解

4 激活CD137信號(hào)促進(jìn)PAECs增殖，抑制糖酵解后其促增殖作用被抑制

CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，CD137激動(dòng)劑組細(xì)胞A值顯著高于對(duì)照組，但是加入糖酵解抑制劑2-DG后，CD137L重組蛋白的促細(xì)胞增殖作用減弱，A值明顯下降(P<0.05)，見圖4A。

EdU檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD137激動(dòng)劑組紅色熒光明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，加入糖酵解抑制劑2-DG后紅色熒光明顯減少(P<0.05)，顯著抑制了CD137信號(hào)的促增殖作用，見圖4B。以上結(jié)果表明，激活CD137信號(hào)會(huì)促進(jìn)PAECs增殖，而2-DG可抑制CD137信號(hào)的促細(xì)胞增殖作用。

Figure 4. The activation of CD137 signaling promoted the proliferation of the PAECs, whereas glycolysis inhibitor 2-DG blocked the proliferation-enhancing effect of CD137 signaling. A: CCK-8 assay for cell viability; B: EdU staining for proliferation (×200). Mean±SD.n=5.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsCD137 agonist group.

圖4 CD137信號(hào)激活促進(jìn)PAECs增殖，抑制糖酵解后促增殖作用被抑制

討 論

PH是一種發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜的疾病，目前病因尚未完全了解。研究顯示,肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮功能障礙是PH的重要啟動(dòng)因素[2]。PAECs是肺血管內(nèi)層的單層扁平細(xì)胞，分泌多種血管活性物質(zhì)，維持血管正常的功能。缺氧、炎癥、血流剪切力以及遺傳因素都能引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致其功能障礙[10]。損傷的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且以旁分泌方式向周圍分泌介質(zhì)，誘導(dǎo)周圍PAECs發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，形成過度增殖和凋亡耐受表型，最終形成特征性的“叢狀損傷”，引起肺小血管閉塞重塑，導(dǎo)致嚴(yán)重的PH[11]。研究表明，即使在氧氣供應(yīng)充足的情況下，PAECs的能量來源主要依賴于有氧糖酵解；而當(dāng)PAECs受損發(fā)生類腫瘤樣增殖時(shí)，其有氧糖酵解反應(yīng)大大增強(qiáng)[4]。因此，尋找及干預(yù)PAECs異常糖代謝的觸發(fā)因素，是治療肺高壓的一個(gè)潛在新靶點(diǎn)。

炎癥共刺激分子CD137是腫瘤壞死因子超家族成員，細(xì)胞表面CD137與其配體CD137L或活化型CD137單抗結(jié)合，激活CD137信號(hào)通路，通過復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，并且以CD137信號(hào)通路為靶點(diǎn)的人源化單抗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[7]。正常的內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD137，本研究發(fā)現(xiàn)在未活化的小鼠PAECs表達(dá)較低的CD137蛋白，而刺激因子TNF-α、ET-1和5-HT刺激后CD137表達(dá)明顯上調(diào)。因此，我們選擇炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)PAECs的CD137表達(dá)后，加入CD137L重組蛋白激活CD137信號(hào)，觀察PAECs功能變化。

我們前期研究證實(shí)，激活的CD137信號(hào)通路能通過Smad1/5-NFATc1信號(hào)促進(jìn)小鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移[12]。本研究中激活CD137信號(hào)后，PAECs葡萄糖消耗增加，細(xì)胞外乳酸水平升高，有氧糖酵解酶HK2和PFKFB3酶活性和蛋白水平均明顯增加，提示激活CD137信號(hào)通路能促進(jìn)PAECs的有氧糖酵解。同時(shí)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，激活的CD137信號(hào)能促進(jìn)PAECs增殖，而有氧糖酵解抑制劑2-DG能抑制CD137信號(hào)的促增殖作用。因此，本研究在體外證實(shí)，激活CD137信號(hào)通路能上調(diào)PAECs有氧糖酵解水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Choi等[9]發(fā)現(xiàn)，激活的CD137信號(hào)通路可促進(jìn)活化CD8+T細(xì)胞的糖酵解及脂肪酸代謝，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。CD137信號(hào)是否也影響PAECs的脂酸代謝有待進(jìn)一步研究。

原癌蛋白c-Myc是myc基因家族的重要成員之一，其在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及凋亡和細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮重要作用[13]。研究表明，c-Myc可通過直接增強(qiáng)糖酵解酶基因轉(zhuǎn)錄或通過核蛋白剪接因子的受控表達(dá)促進(jìn)RNA剪接，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解[14]。本研究表明，激活CD137信號(hào)通路可上調(diào)PAECs的c-Myc蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證c-Myc參與CD137信號(hào)的促糖酵解作用，我們采用c-Myc抑制劑10074-G5沉默c-Myc。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，預(yù)孵10074-G5再激活CD137信號(hào)，有氧糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3和HK2的酶活性及蛋白水平均顯著下降，提示c-Myc參與CD137信號(hào)的促糖酵解作用。因此，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)CD137信號(hào)可能通過上調(diào)c-Myc表達(dá)，促進(jìn)PAECs有氧糖酵解。然而CD137信號(hào)如何上調(diào)PAECs的c-Myc表達(dá)則需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明活化的PAECs中CD137信號(hào)分子表達(dá)增加；激活CD137信號(hào)能上調(diào)c-Myc蛋白水平，增強(qiáng)細(xì)胞有氧糖酵解，從而促進(jìn)PAECs增殖。