韓坤鵬，劉楊，萬鵬

(山東中醫(yī)藥大學， 山東 濟南 250355)

栝樓，其果實稱為瓜蔞，根部稱為栝樓，功能主治肺熱咳嗽、胸痹心痛等癥狀[1-2]。在政府和農(nóng)技部門的十力支持下,長清區(qū)這幾年大力發(fā)展栝樓產(chǎn)業(yè),讓栝樓形成了種植、生產(chǎn)、加工、銷售一條龍的區(qū)域特色產(chǎn)業(yè)，然而根結線蟲病是栝樓重要病害之一，其危害也日趨嚴重，影響瓜農(nóng)的經(jīng)濟效益，對栝樓根結線蟲病的研究有著迫切的需要。

丹參又名赤參，為草本植物，是根部入藥的重點藥材，有活血調(diào)經(jīng)，養(yǎng)血安神之功效[3]。長清區(qū)種植丹參有300余年的歷史，具有適宜藥材生長的自然條件，歷經(jīng)多年研究，也培育出了優(yōu)質丹參。然而根部的病蟲害仍然是困擾丹參種植的主要問題。因此，對丹參根部病蟲害的研究具有重要的意義。

近年來，寄生線蟲尤其是根結線蟲對中藥材的危害，在很大程度上影響了藥材的產(chǎn)量和質量。而關于影響藥材生長的根結線蟲病的研究較少，特別是對藥材栝樓和丹參根結線蟲病的病原蟲研究最近幾年未有新的進展[4-7]，病原也并不明確。為確定長清馬山鎮(zhèn)中藥材線蟲病的主要病原，明確其危害，本實驗提取發(fā)病植株體內(nèi)的線蟲，進行顯微觀察，根據(jù)線蟲的外觀特征初步鑒定病原線蟲，以期為該地區(qū)根結線蟲病的防治起到積極的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 取樣范圍

實驗所需藥材于2017年5月上旬采自濟南市長清區(qū)馬山，5月中旬采自濟南市長清區(qū)山東中醫(yī)藥大學苗圃。

1.1.2 取樣方法

在固定點選取病株，在其植株附近，用鐵锨除去地表其他雜草等物后，挖取10～15 cm土層的根系。

1.1.3 重復取樣

采集丹參標本6份，采集栝樓標本4份，將采集到的植株病根放到事先準備好的封口袋中，在標簽上注明時間和地點。

1.1.4 樣本處理

樣本要立即處理，或冰箱中冷藏(5～10 ℃)。

1.2 實驗方法

1.2.1 線蟲的分離方法

在苗圃將藥材根取回實驗室，用清水輕輕沖干凈病根上的泥土，然后將病根切成0.5 cm左右的細根塊，采用貝曼漏斗法(Baermann funnel)將線蟲與根分離。選用直徑10～14 cm的漏斗，剪取一小段橡膠管接在下方，乳膠管上加一個止水夾后置于漏斗架。在漏斗中裝入無菌清水，將切碎的根塊用兩層韌性好的衛(wèi)生紙包好，放入清水中，水量沒過根塊即可。待24 h之后，將橡膠管上的止水夾打開，收集漏斗底部大概5 cm處液體[8]。

1.2.2 TAF固定液配制

7 mL 體積分數(shù)40%的甲醛與2 mL三乙醇胺加45.5 mL水[9]。

1.2.3 臨時裝片制作與觀察

選一次性滴管吸少量含有線蟲的溶液，滴一滴在載玻片上，蓋上載玻片，不要產(chǎn)生氣泡，然后用濾紙吸取多余液體，防止污染物鏡。在顯微鏡下觀察線蟲特征。

1.2.4 線蟲的滅活與固定

試管取3 mL線蟲溶液，將水浴鍋加熱到65 ℃，試管用試管夾夾住，在水浴鍋內(nèi)加熱2～ 3 min，直到線蟲死亡，立即加入3 mLTAF固定液(等量即可)[10-11]。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲病癥狀描述

感染根結線蟲病的病根上有類圓形根結，單個或成串，成念珠狀，癥狀明顯。其主要危害在于根部瘤狀突起、腐爛、生長不良、漚根，同時也會使植株枯枝枯葉、黃化，扭曲萎蔫、植株矮小、生長緩慢。生病根上生長著很少的須根，老根也會反復侵染線蟲，長成形態(tài)較大的不規(guī)則類圓形凸起。開始為白色，10～12 d后會呈黑色，易腐爛，脫落，木質部露出[12-13]。待線蟲長到一定大小可以在解剖鏡下直接解剖提取線蟲，線蟲形態(tài)小，身體透明，需得借助光學顯微鏡等儀器觀察[14]。

2.2 病原種類鑒定

2.2.1 丹參植物根中根結線蟲主要類型

2.2.1.1 南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)

新幼蟲特征：唇部平坦；有球形中食道，瓣門突出；尾部無色透明，身體末端有明顯特征，尾部有小部分皺縮。幼蟲尾尖尖圓。如圖1所示。

A線蟲尾部(×400) ；B線蟲頭部(×400)；C線蟲整體觀(×200)圖1 南方根結線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.1 Morphology of Meloidogyne incognita under optical microscope

2.2.1.2 纖毛棘刺線蟲(Helicotylenchusapiculus)

雄蟲：線蟲經(jīng)溫熱殺死后呈直線形或稍稍向內(nèi)彎曲，雄蟲比雌蟲略長，體形更加纖細。雄蟲口針較不發(fā)達，食道部分退化。交合傘長包至尾端后。如圖2所示。

實驗材料中未見雌蟲。

A線蟲頭部(×400) ；B線蟲中部(×400)；C線蟲尾部(×400)圖2 纖毛棘刺線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.2 Morphology of Helicotylenchus apiculus underoptical microscope

2.2.1.3 咖啡短體線蟲 (Pratylenchuscoffeae)

雌蟲：體形粗短，經(jīng)溫熱殺死后蟲體變僵直或略彎曲。皮紋明顯，有4條側線，側帶非網(wǎng)狀。唇區(qū)低且稍皺縮，2 條平唇環(huán) 。頭架輕度骨化，向蟲體后延伸一個體環(huán)的距離?？卺槾侄糖野l(fā)達，基部球呈圓形。背食道腺在口針基部球。有類圓形中食道球。有前伸單卵巢。尾部呈類圓柱形，尾端無紋，多數(shù)平截，少部分線蟲尾部有一個明顯的凹痕。

雄蟲：雌、雄蟲數(shù)目特征基本一致。雄蟲的前體較窄，口針基部球寬度上退化明顯。雄蟲的交合刺成對存在，纖細，約 17 μm。如圖3所示。

A線蟲頭部(×400)； B線蟲尾部(×400)；C線蟲整體觀(×200)圖3 咖啡短體線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.3 Morphology of Pratylenchus coffeae under optical microscope

2.2.1.4 穿刺短體線蟲 (Pratylenchuspenetrans)

雌蟲：線蟲水浴加熱殺死后蟲體僵直或稍稍向腹部彎曲，體紋纖細;唇區(qū)較高，無皺縮，唇環(huán)3 ，前部平坦。頭架較發(fā)達，外緣向后延伸與第 1 條體環(huán)相連。口針發(fā)達且粗短，有較寬的基部球?；壳蛟诒呈车老偾胺?。雌蟲中食道球近圓形，清晰易觀察，瓣膜明顯，寬度約等于該處體的半徑。單卵巢，有較大的圓形受精囊，約等于3/4體寬的 ，可見其充滿精子。陰道長約體寬的 1/4，較直。尾部體環(huán)明顯，尾的中上部有側尾腺口。蟲尾呈錐形或錐圓形，末端鈍圓無紋。 如圖4所示。

樣本中未見雄蟲。

A線蟲整體觀(×200)； B線蟲頭部(×400)； C線蟲尾部(×400)圖4 穿刺短體線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig.4 Morphology of Pratylenchus penetrans under the optical microscope

2.2.1.5 美洲劍線蟲(Xiphinemaamericanum)

雄蟲：有高唇區(qū)，呈球形，骨化不明顯。唇環(huán)有3到5 個，縊縮，側唇、食道、口針皆退化，中食道球和瓣膜不明顯，針狀口針，無基部球。單精巢。復合刺強壯，末端尖。交合傘至尾長 2/3 處，雄蟲末端純圓或尖。如圖5所示。樣本中未見雌蟲。

A線蟲頭部(×400)； B線蟲尾部(×400)； C線蟲整體觀(×200)圖5 美洲劍線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig. 5 Morphology of Xiphinema americanum under the optical microscope

2.2.2 栝樓中主要線蟲類型

2.2.2.1 假強壯螺旋線蟲 (Helicotylenchuspseudorobustus)

蟲體經(jīng)水浴加熱殺死后，大部分線蟲體前端較直而尾端彎成環(huán)形，有少部分彎曲較大呈 “C” 形。蟲體側區(qū) 4 條側線，體前端網(wǎng)格化。半圓形唇區(qū)，與蟲體相連無間隔，有若干個不太明顯的環(huán)紋?？卺槹l(fā)達，基部球明顯，前部平坦或稍稍凹起。有卵圓形的中食道球，位于排泄孔后方。受精囊呈卵形。線蟲尾部有明顯的腹突和細紋。側尾腺開口先于肛門，呈小孔狀。如圖6所示。

A線蟲尾部(×400)； B線蟲頭部(×400)；C線蟲整體觀(×400)圖6 假強壯螺旋線蟲光學顯微鏡下形態(tài)Fig 6 Morphology of Helicotylenchus pseudorobustus under the optical microscope

2.2.2.2 美洲劍線蟲 (Xiphinemaamericanum)

雌蟲：蟲體中部圓柱形，頭部和尾部較之細，水浴65 ℃加熱殺死后，蟲體呈“C”形或“J”形。表皮環(huán)紋很細。唇區(qū)前端平坦，中部稍稍凹起，頭部縊縮。齒針長 128～143 μm，齒針延伸部分的基部膨大。食道與腸分界清晰。對伸雙卵巢。陰門長約體寬的1/4，位于體長2/1處。尾圓錐形，背面略拱起，尾長于肛門處體寬， 有尾乳突約4個。 幼蟲水浴加熱殺死后呈“C”形。如圖7所示。

圖7 美洲劍線蟲光學顯微鏡下形態(tài)(×200)Fig. 7 Morphology of Xiphinema americanum under the optical microscope

3 討論與結論

瓜蔞和丹參是我省重要的道地藥材，隨著種植年限的延長和連作面積的增加，丹參和栝樓根部病害發(fā)生逐年加重，給這兩種植物的生產(chǎn)安全帶來嚴重威脅。但目前對根結線蟲病害的研究還遠遠不夠。

本文根據(jù)對長清地區(qū)6份丹參樣本、4份栝樓樣本共 10份樣本的分離鑒定，共鑒定出以下6種線蟲：咖啡短體線蟲(Pratylenchuscoffeae)、南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)、纖毛棘刺吸蟲(Helicotylenchusapiculus)、美洲劍線蟲(Xiphinemaamericanum)、穿刺短體線蟲(Pratylenchuspenetrans)、假強壯螺旋線蟲(Helicotylenchuspseudorobustus)。根據(jù)以上結果，說明感染植物根結線蟲病的藥材根中并非只有一種線蟲，即藥材根結線蟲病發(fā)生時可能被多種線蟲感染。實驗中所取的感染根結線蟲病的丹參病根中以咖啡短體線蟲數(shù)量最多，其次是美洲劍線蟲。

本研究結果表明，一些植物根寄生線蟲雖然寄主多樣，但不同植物的根結線蟲有很大差異，對于每種的線蟲具體防治方法需要更深一步地探討。因此，在丹參與栝樓的種植過程中，為防治根結線蟲的危害，應盡量選用無病種苗、合理施肥、科學輪作、倒茬和寬、窄行高壟栽培等農(nóng)業(yè)措施為主，移栽前穴施毒土、藥液浸根和生長期藥劑灌根相結合的綜合防治措施，這樣能夠更加高效且綠色環(huán)保地促進丹參和栝樓的種植和產(chǎn)量。