陳新 徐麗 張力思 魏海蓉 宗曉娟 王甲威 譚鉞 朱東姿 洪坡 劉慶忠

摘要：鯊烯合酶基因（SQS）在植物三萜類化合物合成途徑中起著重要作用，是上游代謝通路中的關(guān)鍵基因。本研究采用RT-PCR技術(shù)從‘喜來(lái)藍(lán)莓根中克隆得到VcSQS基因，序列全長(zhǎng)1489bp，序列分析結(jié)果表明，其含有1242bp的開放閱讀框，編碼413個(gè)氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍(lán)莓與其它物種SQS蛋白氨基酸序列相似性很高，與山茶科的茶相似性最高，達(dá)90.58%，與葡萄相似性達(dá)87.92%。熒光定量試驗(yàn)結(jié)果表明，SQS基因在藍(lán)莓葉中的表達(dá)量最高，芽中的最低。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;角鯊烯合酶基因;同源序列分析;熒光定量

中圖分類號(hào)：S663.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）05-0001-06

我國(guó)藍(lán)莓的種植面積和產(chǎn)量逐年遞增，其鮮果多直接食用或加工成一些初級(jí)產(chǎn)品果汁、果醬等，缺乏對(duì)其高附加值產(chǎn)品的探索。研究表明，藍(lán)莓果實(shí)富含多種具有良好保健作用的功能活性物質(zhì)，果內(nèi)糖、酸、礦物元素、尼克酸、SOD、黃酮含量非常豐富[1];藍(lán)莓除含黃酮類物質(zhì)和多酚外，還含有三萜類物質(zhì)熊果酸和齊墩果酸[2]。

熊果酸（ursolicacid，UA），分子式為C30H48O3，分子量為456.68，是存在于植物中的五環(huán)三萜類化合物，具有一定的生物活性和重要的藥理作用[2-6]。已有研究證明熊果酸具有抗腫瘤、抗癌、保肝、消炎等多種功效，能夠抵抗多種致癌及促癌物。張秋萍等[7]認(rèn)為熊果酸對(duì)人白血細(xì)胞K562的體外增殖有一定的抑制作用，其抑制效果與所用劑量成正比，并且能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。Kassi等[8]證明熊果酸可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3和LNCaP。此外，熊果酸中含有脂羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗氧化能力強(qiáng)，能夠清除自由基，具有美白護(hù)膚的功效，多用于化妝品添加物。由于其特殊的藥理作用，熊果酸被推崇為最具潛力的抗癌藥物之一。另有研究發(fā)現(xiàn)熊果酸對(duì)化學(xué)藥品引起的肝損傷擁有比齊敦果酸更好的療效[9]。因此，藍(lán)莓三萜類物質(zhì)的研究對(duì)于癌癥等疾病的治療具有深遠(yuǎn)意義。

三萜類化學(xué)物質(zhì)的合成主要依賴的合成途徑是類異戊二烯代謝途徑[10]。鯊烯合酶分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，兩分子的法尼基焦磷酸在該酶的催化下，生成一分子的鯊烯[11]，而鯊烯是三萜類化合物的第一個(gè)前提物質(zhì)[12]。所以，對(duì)控制鯊烯合酶合成的基因SQS的研究顯得尤其重要，有助于我們?cè)诜肿铀缴侠没蚬こ痰氖侄螌?shí)現(xiàn)三萜皂苷的規(guī)?；a(chǎn)。

大多數(shù)植物的SQS以基因家族的形式存在，其在不同物種中除成員數(shù)量不同，表達(dá)量也存在差異[13，14]。研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6種SQS基因異構(gòu)型，能夠編碼1～3種有功能的鯊烯合酶，另外的4～6種沒(méi)有催化活性[15];在所有組織中SQS1異構(gòu)型均有表達(dá)，而SQS2不同，主要在葉脈中表達(dá)[16]。人參有3個(gè)異構(gòu)型的基因，都可催化角鯊烯的合成[10];北柴胡有2個(gè)SQS基因的氨基酸同源序列相似性達(dá)到96%[17]。由此可以看出，同一物種不同異構(gòu)型的SQS基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列相對(duì)保守。現(xiàn)已克隆出多種植物的SQS基因，并在分子水平上對(duì)植物體內(nèi)的三萜類物質(zhì)的代謝做了深入研究。

本研究利用RT-PCR技術(shù)從藍(lán)莓中克隆到VcSQS基因，并與其它物種的SQS氨基酸序列進(jìn)行同源對(duì)比，同時(shí)分析該基因在不同組織中的表達(dá)水平，以期探明鯊烯合酶在不同物種間的保守性及進(jìn)化關(guān)系，并為進(jìn)一步探究SQS基因表達(dá)與三萜皂苷類含量的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料‘喜來(lái)藍(lán)莓根取自山東省果樹研究所泰東苗圃。取材后用液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA的提取及cDNA的合成

利用TaKaRaMiniBESTPlantRNA提取試劑盒提取藍(lán)莓根RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶的完整性。將提取后的RNA參照abmgood|5XAll-In-OneRTMasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3VcSQS基因的克隆

根據(jù)已知其它植物SQS基因設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以cDNA為模板，擴(kuò)增目的片段VcSQS。PCR反應(yīng)體系為20μL：模板0.5μL，上下游引物F、R各0.6μL，dNTP1.6μL，TaqDNAPoly-merase0.1μL，5×Buffer4μL，補(bǔ)水至終體積20μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min;98℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，拍照并記錄試驗(yàn)結(jié)果。使用OMEGA公司的凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將純化得到的目的片段連接到克隆載體pTOPO-Blunt上，轉(zhuǎn)化、篩菌后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，驗(yàn)證全長(zhǎng)序列的準(zhǔn)確性。

1.4生物信息學(xué)分析

將序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast比對(duì)分析，搜索并下載其它物種的序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行不同物種間氨基酸序列同源性分析，利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5VcSQS基因組織表達(dá)特性

所用VcSQS基因qRT-PCR的引物（表1）由通用生物公司合成。利用DBI公司的SYBRGREEN進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為20μL：模板為2μL，正反向引物各0.5μL，mix10μL，ddH2O7μL。利用ABI7500熒光定量?jī)x采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃120s，95℃10s，60℃30s，循環(huán)40次后進(jìn)行熔解曲線分析。每樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔct的計(jì)算方法分析相對(duì)表達(dá)量。以藍(lán)莓青果的表達(dá)量為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1VcSQScDNA的克隆分析

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增條帶大小為1500bp左右，與預(yù)期一致，可初步判斷得到VcSQS基因。使用凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，再次電泳，得到與PCR產(chǎn)物大小一致的條帶（圖2）。

2.2VcSQS基因的獲得及序列分析

利用RT-PCR和RACE技術(shù)從藍(lán)莓根中成功克隆VcSQS基因，序列全長(zhǎng)為1489bp。其含有1242bp的開放閱讀框，共編碼413個(gè)氨基酸（圖3）。

2.3藍(lán)莓VcSQS的同源序列分析

利用DNAMAN軟件對(duì)推導(dǎo)的藍(lán)莓VcSQS氨基酸序列與其它物種進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖4）顯示，其與甘藍(lán)、薺藍(lán)、水稻、蓖麻的同源性在70%～80%之間;與甘藍(lán)的同源性最低，為70.79%;與另外10種植物的同源性都在80%以上，與茶的同源性達(dá)到90.58%?？傮w而言，藍(lán)莓與所參考的14種植物SQS蛋白的氨基酸序列相似性較高。

2.4藍(lán)莓VcSQS的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了更加清晰地看出藍(lán)莓VcSQS與其它植物SQS之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA7.0軟件，在多重比較的基礎(chǔ)上，將包括藍(lán)莓在內(nèi)的15種植物的SQS蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。藍(lán)莓SQS與山茶科植物茶為一個(gè)類群，親緣關(guān)系最近，與葡萄的親緣關(guān)系也較近;與其它種屬植物的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，這與氨基酸序列同源性結(jié)果一致。這表明SQS基因具有種屬特異性。

2.5藍(lán)莓VcSQS基因在不同組織相對(duì)表達(dá)量分析

本試驗(yàn)分別提取藍(lán)莓的青果、紫果、花、葉、芽、根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行熒光定量分析。由圖6可以看出，藍(lán)莓不同組織中VcSQS基因相對(duì)表達(dá)量的高低依次為葉、青果、根、花、紫果、芽。

3討論與結(jié)論

三萜類化合物具有良好的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)其有關(guān)次生代謝產(chǎn)物合成的基因調(diào)控研究現(xiàn)已發(fā)展成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。角鯊烯合酶SQS在三萜類化合物合成途徑中發(fā)揮重要作用，是上游代謝通路中的一個(gè)關(guān)鍵酶。目前，關(guān)于角鯊烯合酶的研究多集中于藥用植物人參、刺五加等，對(duì)藍(lán)莓的SQS研究較少。本研究以‘喜來(lái)藍(lán)莓品種為試材，從根中成功克隆VcSQS基因，序列分析表明，VcSQS基因含有1242bp的開放閱讀框，編碼413個(gè)氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍(lán)莓與山茶科的茶相似性最高，達(dá)90.58%，與葡萄相似性達(dá)87.92%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明藍(lán)莓SQS與山茶科植物茶親緣關(guān)系最近，為一個(gè)類群，與葡萄的親緣關(guān)系也較近，同源序列比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹得到的結(jié)論一致。熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，VcSQS基因在藍(lán)莓的果實(shí)、花、葉、芽、根組織器官中均有表達(dá)，葉中的表達(dá)量最高，芽中的表達(dá)量最低，青果中的表達(dá)量高于紫果。邢朝斌等[18]對(duì)刺五加角鯊烯合酶基因的研究表明SQS在葉片中的表達(dá)量要高于根。這與本研究中得出的葉中高于根中的結(jié)果一致。由此證明很有可能對(duì)于不同的物種來(lái)說(shuō)葉中SQS基因表達(dá)量相對(duì)較高。但對(duì)于利用基因工程技術(shù)使SQS基因在指定組織中得到高效異源表達(dá)，進(jìn)而提高三萜類物質(zhì)的合成，仍需進(jìn)一步探究。

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