李亞萍 周孟祺 李穩(wěn) 程惠敏 謝先芝

摘要：水稻光敏色素基因家族包括3個(gè)成員：PHYA、PHYB和PHYC。已有研究表明，phyB在調(diào)節(jié)水稻幼苗去黃化、葉角、花期以及非生物脅迫反應(yīng)中具有重要作用，但是phyB對(duì)水稻苗期株高和生物量的影響仍未有報(bào)道。本研究比較了野生型和phyB突變體（phyB1和phyB2）在不同培養(yǎng)條件下苗期的株高、鮮重和干重，結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)液和基質(zhì)培養(yǎng)條件下，phyB突變體的株高均顯著低于野生型，鮮重和干重與野生型差異并不明顯，據(jù)此推測(cè)，phyB調(diào)控水稻苗期株高，但對(duì)生物量的影響不明顯。利用基因芯片技術(shù)，比較了野生型和phyB突變體苗期地上部分的基因表達(dá)圖譜，篩選到受phyB上調(diào)的基因115個(gè)，受phyB下調(diào)的基因95個(gè);差異基因的GO富集分析結(jié)果表明，富集的基因主要參與水稻生長(zhǎng)等生物學(xué)功能，因此推測(cè)通過調(diào)控這類基因的表達(dá)而影響苗期生長(zhǎng)。本研究首次揭示了phyB對(duì)水稻苗期株高和生物量的影響，并進(jìn)一步討論了phyB在選育機(jī)插秧水稻品種中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：水稻;光敏色素B;苗期;生物量;株高

中圖分類號(hào)：S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）05-0013-06

光不僅為植物的光合作用提供能量，而且作為一種信號(hào)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。光敏色素（phytochrome）是植物體內(nèi)的一種重要光受體，主要感受紅光和遠(yuǎn)紅光，在植物從種子萌發(fā)到成熟的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[1，2]。水稻光敏色素基因家族包括3個(gè)成員：PHYA、PHYB和PHYC[3，4]。Takano等的研究表明水稻phyB通過感受紅光可以調(diào)節(jié)水稻幼苗去黃化、葉角、花期以及育性等[5]。而且，phyB還影響水稻的耐寒性和耐旱性[6，7]。

除了對(duì)形態(tài)建成和脅迫反應(yīng)的調(diào)控，水稻光敏色素也參與調(diào)控碳代謝。有報(bào)道表明，水稻phyAphyBphyC三突變體白天的糖含量，特別是新葉中的還原糖、葡萄糖、果糖和半乳糖含量顯著高于野生型;黑暗條件下，水稻phyAphyBphyC三突變體中的淀粉含量高于野生型，表明光敏色素影響黑暗中淀粉的利用[8]。此外，光敏色素還影響三羧酸循環(huán)組分的含量[8，9]。在其它植物中的研究也表明，光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)與碳代謝及植物生長(zhǎng)可塑性密切相關(guān)[10]。植物碳代謝主要包括光合作用驅(qū)動(dòng)的糖類合成代謝及呼吸作用介導(dǎo)的糖類分解代謝。碳代謝所產(chǎn)生的淀粉是植物體內(nèi)碳的主要儲(chǔ)存形式，是構(gòu)成植物生物量的基本組分之一[11]。據(jù)此推測(cè)光敏色素影響水稻的生物量。

為了解析PHYB基因?qū)λ久缙谥旮吆蜕锪康挠绊懀狙芯勘容^了野生型和phyB突變體水稻在不同生長(zhǎng)條件下的干重、鮮重和株高等特性，并利用基因芯片技術(shù)分析了phyB突變體的基因表達(dá)譜，以進(jìn)一步討論phyB突變體苗期的這種生長(zhǎng)發(fā)育和代謝特征在水稻機(jī)插秧品種改良中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用水稻材料共3個(gè)，分別是日本晴（WT）及其phyB1和phyB2突變體。phyB1和phyB2突變體為日本晴經(jīng)γ-射線輻射誘變獲得，具體遺傳背景見文獻(xiàn)[5]。

1.2營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下水稻株高、干重和鮮重的測(cè)量

將野生型、phyB1和phyB2突變體種子用70%乙醇表面消毒1min、5%（活性氯含量）NaClO溶液表面消毒20min后，無菌水沖洗4～5次;置于28℃誘導(dǎo)萌發(fā)3d，然后播種于96孔板（底部去掉），轉(zhuǎn)移至Yoshida溶液中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光溫條件是光期14h、28℃、7900lx，暗期10h、24℃。分別在Yoshida溶液中培養(yǎng)10、15、20、25d時(shí)測(cè)量水稻株高，并以野生型水稻的株高為100%，計(jì)算phyB1和phyB2突變體的相對(duì)高度。每?jī)商旄鼡Q一次溶液。每個(gè)材料測(cè)量至少20株。

每5株作為1組測(cè)量整株鮮重，然后在105℃殺青30min，80℃烘6d至恒重。利用分析天平稱量干、鮮重。

1.3基質(zhì)培養(yǎng)條件下水稻株高、干重和鮮重的測(cè)量

將野生型、phyB1和phyB2突變體種子消毒后在28℃誘導(dǎo)萌發(fā)4d。挑選萌發(fā)一致的種子播種到基質(zhì)（濟(jì)南魯青育苗基質(zhì)）中，在濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)（36°40′N，117°00′E）的網(wǎng)室中培養(yǎng)（2017年6—7月，自然生長(zhǎng)條件）。分別于培養(yǎng)10、15、20、25d時(shí)測(cè)量水稻株高，并以野生型水稻的株高為100%，計(jì)算phyB1和phyB2突變體的相對(duì)高度。每個(gè)材料測(cè)量至少30株。

干重和鮮重的測(cè)量如上所述。

1.4基因芯片分析

對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)至三葉期的野生型、phyB1和phyB2突變體地上部分進(jìn)行取材，利用RNeasyPlantMiniKit（QIAGEN）提取RNA，然后利用22KOligo-microarray（AgilentTechnologies，USA）進(jìn)行基因芯片分析，具體方法參考文獻(xiàn)[12]。選擇在野生型和phyB突變體中表達(dá)水平差異2倍的基因作為差異表達(dá)基因，并利用AgriGOv2.0在線軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

采用MicrosoftExcel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與做圖。

2結(jié)果與分析

2.1營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下野生型和phyB突變體的株高、鮮重和干重

在營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)不同時(shí)間后，野生型的株高均顯著高于phyB1和phyB2突變體，且各時(shí)期phyB突變體相對(duì)于野生型的株高基本不變，均在73%～80%之間（圖1）。表明，PHYB基因功能缺失導(dǎo)致株高降低。

有研究表明，光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)與碳代謝和植物生長(zhǎng)可塑性密切相關(guān)[10]。因此，我們進(jìn)一步比較了野生型和phyB突變體的干重和鮮重。在萌發(fā)后10d時(shí)，phyB突變體的鮮重顯著高于野生型，干重僅phyB2差異顯著;在萌發(fā)后15d和20d時(shí)，野生型和phyB突變體的鮮重和干重均無顯著差異;但在萌發(fā)后25d時(shí)，phyB1和phyB2突變體苗期的鮮重和干重均顯著低于野生型（圖2），這可能是由于營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)后期材料密度太大，導(dǎo)致生長(zhǎng)不正常。上述結(jié)果表明，PHYB基因功能缺失在苗期不影響水稻的生物量。

2.2基質(zhì)培養(yǎng)的野生型和phyB突變體的株高、鮮重和干重

為了模擬大田生長(zhǎng)情況，我們比較了野生型、phyB1和phyB2突變體在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)不同時(shí)期的株高、鮮重和干重。在萌發(fā)后不同天數(shù)，野生型的株高均高于phyB1和phyB2突變體，但是隨著發(fā)育進(jìn)程，株高的差別逐漸縮?。▓D3）。如在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)15d時(shí)，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的75.3%和74.2%;在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)20d時(shí)，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的82.9%和82.0%;在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)25d時(shí)，phyB1和phyB2突變體株高分別為野生型的97.3%和95.7%。

我們進(jìn)一步比較了野生型和phyB突變體的鮮重和干重。在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)10d時(shí)，phyB1突變體的鮮重和干重均顯著高于野生型;但生長(zhǎng)15d時(shí)，phyB1突變體的鮮重和干重均顯著低于野生型;生長(zhǎng)20d和25d時(shí)，除25d時(shí)phyB1的干重顯著高于野生型外，野生型和phyB突變體的鮮重和干重?zé)o顯著差異（圖4）。表明，在自然光照下，PHYB基因功能缺失在苗期不影響水稻的生物量。

2.3phyB調(diào)控的基因表達(dá)圖譜

上述結(jié)果表明，野生型和phyB突變體之間苗期株高存在明顯差異。此外，野生型和phyB突變體葉角和葉綠素含量也顯著不同[5，13]。為了揭示phyB調(diào)控水稻苗期生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，我們比較了野生型和phyB突變體之間的基因表達(dá)圖譜。結(jié)果顯示，野生型和phyB突變體之間的差異表達(dá)基因210個(gè)，其中受phyB上調(diào)（即在WT中表達(dá)水平高于phyB突變體的2倍以上）的差異表達(dá)基因115個(gè)，受phyB下調(diào)（即在WT中表達(dá)水平低于phyB突變體的2倍以上）的差異表達(dá)基因95個(gè)。利用AgriGOv2.0在線軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，受phyB上調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與生長(zhǎng)（GO：0040007：growth）、外部刺激應(yīng)答（GO：0009605：responsetoexternalstimulus）和蛋白磷酸化（GO：0006468：proteinphosphorylation）等生物學(xué)過程（圖5）;受phyB下調(diào)的差異表達(dá)基因主要參與生長(zhǎng)（GO：0040007：growth）、系統(tǒng)發(fā)育（GO：0048731：systemdevelopment）和生殖過程（GO：0022414：reproductiveprocess）等生物學(xué)功能（圖6）。不管在上調(diào)基因還是下調(diào)基因中，富集的基因均與水稻生長(zhǎng)生物學(xué)過程（GO：0040007：growth）有關(guān)，推測(cè)phyB通過調(diào)控這類基因的表達(dá)而影響水稻苗期株高。

3討論與結(jié)論

本研究比較了野生型和phyB突變體苗期株高和生物量（干重和鮮重），結(jié)果顯示，在兩種培養(yǎng)條件下，phyB突變體的株高均顯著低于野生型，這表明phyB影響水稻苗期株高。利用基因芯片篩選到受phyB上調(diào)的差異表達(dá)基因115個(gè)，受phyB下調(diào)的差異表達(dá)基因95個(gè);差異基因GO富集分析結(jié)果表明，最富集的一類基因主要參與生長(zhǎng)生物學(xué)過程，這可能與phyB突變體水稻株高、葉角等苗期生長(zhǎng)發(fā)育特征有關(guān)。

在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)中（自然光照條件下），phyB突變體的相對(duì)株高大于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件下的相對(duì)株高。考慮到Y(jié)oshida溶液中含有水稻生長(zhǎng)所需要的各種營(yíng)養(yǎng)元素，我們推測(cè)，在不同培養(yǎng)條件下株高上的差異主要是由于光照強(qiáng)度或者光質(zhì)導(dǎo)致的。PHYB編碼光敏色素蛋白質(zhì)，主要感受紅光，因此環(huán)境中的光質(zhì)必定會(huì)影響光敏色素突變體的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，植物體內(nèi)的其他光受體如主要感受藍(lán)光的隱花色素和向光素，以及主要感受紫外光的受體UVR8也能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。因此有一種可能性是自然光中具有更廣的光譜，誘發(fā)了其他光受體的作用，彌補(bǔ)了phyB缺失所引起的株高損失。值得注意的是，在兩種生長(zhǎng)條件下，phyB突變體和野生型之間的鮮重和干重差異不顯著，推測(cè)phyB不影響水稻苗期的生物量。

水稻是我國(guó)播種面積最大、總產(chǎn)量最多的糧食作物，是我國(guó)65%左右人口的主食，在糧食生產(chǎn)和消費(fèi)中處于主導(dǎo)地位。傳統(tǒng)水稻種植通常經(jīng)過播種、育秧、插秧等多個(gè)步驟，用工多，耗時(shí)長(zhǎng)。近幾年隨著農(nóng)村勞動(dòng)力外出務(wù)工的增多，我國(guó)水稻生產(chǎn)用工矛盾越來越突出。機(jī)插秧是用插秧機(jī)高效插秧代替原始手插的高產(chǎn)栽培技術(shù)，徹底解除了人工插秧的繁重勞動(dòng)。然而機(jī)插秧對(duì)秧苗高度和秧苗質(zhì)量要求很高，其中秧齡彈性是研究的核心，只有具有較大秧齡彈性范圍，才能使機(jī)插水稻的推廣和應(yīng)用具有更強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性。如果水稻品種秧苗期株高較低，可以提高秧齡彈性，有利于機(jī)插秧的推廣。然而目前水稻矮化品種在整個(gè)水稻生育期都表現(xiàn)矮化，導(dǎo)致生物量和產(chǎn)量降低。因此需要培育在秧苗期株高較低，成株期生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)的水稻品種。本研究中基質(zhì)生長(zhǎng)試驗(yàn)基本模擬了水稻育苗階段的生長(zhǎng)情況，種子萌發(fā)后在基質(zhì)中生長(zhǎng)的1個(gè)月內(nèi)，phyB突變體的株高低于野生型，而干重和鮮重差別不大，而且在生長(zhǎng)后期，phyB突變體株高與野生型株高的差異逐漸縮小。phyB突變體的這種生長(zhǎng)特征可能更適合于機(jī)插秧栽培方式。因此PHYB基因可以作為一個(gè)培育機(jī)插秧水稻品種的潛在改良位點(diǎn)。

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