張宴萍 亓斐 徐勤省 鮑印廣 王洪剛 李興鋒

摘要：黑麥屬作為小麥的三級(jí)基因源，具有抗多種病害及耐逆性強(qiáng)等特性，是小麥遺傳改良重要的近緣植物之一。本研究利用CIMMYT引進(jìn)的六倍體小黑麥20090148與普通小麥材料復(fù)合雜交，從雜交后代中篩選出了四份遺傳穩(wěn)定、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，對其抗病性等性狀特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，并利用寡核苷酸探針套進(jìn)行染色體原位雜交鑒定，以明確其遺傳組成。結(jié)果表明127-12-2、134-5-1和125-3-1為小麥-黑麥漸滲系，131-2-3為代換系;通過將131-2-3與其親本進(jìn)行核型比對，發(fā)現(xiàn)其染色體組成。四份小黑麥材料的性狀和遺傳組成鑒定，將為它們在小麥遺傳改良上的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小黑麥;農(nóng)藝性狀;抗病性;染色體原位雜交

中圖分類號(hào)：S512.403.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）05-0007-06

小麥（TriticumaestivumL.）作為我國三大糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系到國家的糧食安全。培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥新品種，對于我國小麥產(chǎn)量穩(wěn)定和糧食安全起著舉足輕重的作用。小麥育種水平的高低很大程度上取決于掌握種質(zhì)資源的數(shù)量、質(zhì)量及對其研究的深度和廣度[1]。但目前小麥品種遺傳改良過程中，由于較長時(shí)期以來集中利用少數(shù)親本材料，導(dǎo)致育成小麥品種的遺傳多樣性降低，產(chǎn)量和適應(yīng)性難以突破[2];普通小麥中許多優(yōu)良抗性基因逐漸失去抗性，小麥種內(nèi)遺傳資源日趨匱乏，已成為限制小麥遺傳改良取得重大突破的重要瓶頸之一。

黑麥（Secalecereale，RR，2n=14）作為小麥的近緣物種，蘊(yùn)藏著豐富的白粉病、葉銹病、條銹病和稈銹病等抗性基因，是小麥改良的重要基因資源。將黑麥抗病基因?qū)氲叫←溨?，可以增?qiáng)小麥抗性并改良小麥品質(zhì)，對實(shí)現(xiàn)小麥高產(chǎn)高抗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。小黑麥?zhǔn)呛邴溣幸婊蜣D(zhuǎn)入小麥形成的典型雙二倍體，分為四倍體（AARR，2n=28）、六倍體（AABBRR，2n=42）、八倍體（AABBDDRR，2n=56）及十倍體（AABBDDRRRR，2n=70），在生產(chǎn)上利用最廣泛、價(jià)值最高的屬六倍體和八倍體小黑麥。六倍體小黑麥將小麥的早熟、品質(zhì)優(yōu)良與黑麥的耐逆境脅迫、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)結(jié)合在一起，是轉(zhuǎn)移黑麥優(yōu)良基因的橋梁材料。

利用黑麥基因資源改良小麥品種的最理想方式就是創(chuàng)制小麥-黑麥易位系。目前已報(bào)道了眾多的小麥-黑麥易位系，但只有1RS/1BL易位被成功利用。2012年，毛勇以高感條銹病的小麥品種綿陽11（MY11）和免疫條銹病的白粒黑麥自交系后代雜交，檢測到雜交后代中產(chǎn)生了新的高抗條銹病的小麥-黑麥1RS/1BL易位系[3];同年，賈舉慶等將綿陽11與波斯小麥-非洲黑麥雙二倍體雜交，在F6代篩選到大量新的易位系材料，并且其中有許多是漸滲系[4]。2013年，李宇新等利用小麥-黑麥二體代換系間雜交，發(fā)現(xiàn)可顯著提高易位系產(chǎn)生的頻率[5]。

外源遺傳物質(zhì)的有效轉(zhuǎn)移與利用在相當(dāng)大程度上依賴于對小麥背景中外源染色體或染色體片段的準(zhǔn)確、快速、簡便追蹤及鑒定。本研究應(yīng)用寡核苷酸探針套，對綜合農(nóng)藝性狀較好的小黑麥-普通小麥雜交后代127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）與基因組原位雜交（genomicinsituhybridization）技術(shù)結(jié)合的鑒定，可以同時(shí)區(qū)分黑麥1R～7R染色體并構(gòu)建小麥染色體和外源黑麥染色體的核型，極大地提高遺傳材料的鑒定效率。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料為從CIMMYT引進(jìn)的六倍體小黑麥20090148與多個(gè)普通小麥材料復(fù)合雜交得到的多份后代種質(zhì)材料。對其中綜合農(nóng)藝性狀較好且穩(wěn)定遺傳的四份種質(zhì)材料127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1進(jìn)行綜合分析和鑒定。所用普通小麥親本包括萊州137、濟(jì)麥22（JM22）、SN224及SN4076-1等。以輝縣紅作為感病對照。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1農(nóng)藝性狀調(diào)查參照李立會(huì)等的《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[6]，對株高、穗長、芒、株型和穗型等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2抗病性鑒定（1）苗期白粉病抗性鑒定：在培養(yǎng)箱內(nèi)接種白粉病E09菌種，設(shè)置培養(yǎng)箱相對濕度為60%，光照強(qiáng)度為60%，光周期為光照14h、黑暗10h，對應(yīng)溫度為20℃和18℃。在苗盤內(nèi)以感病對照輝縣紅種植感染行，待第一片葉充分展開時(shí)，將白粉菌孢子接種到供試材料上，接種10～15d后，當(dāng)輝縣紅充分發(fā)病時(shí)，參照盛寶欽（1988）[7]提出的0～4六級(jí)反應(yīng)型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性，其中，0型指免疫;0;型指有壞死反應(yīng)，葉片有枯死斑;1型指高抗;2型指中抗;3型指中感;4型指高感。

（2）成株期白粉病鑒定：在大田進(jìn)行成株期白粉病抗性鑒定，種植輝縣紅作為感染行，待輝縣紅充分發(fā)病后，采集病菌抖撒在供試材料葉片上，同時(shí)借助感染行誘發(fā)感染，按照0～4六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性。

（3）成株期條銹病鑒定：參照NY/T1443.1—2007《小麥抗病蟲性評價(jià)技術(shù)規(guī)范》第1部分《小麥抗條銹病評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，在小麥拔節(jié)期進(jìn)行人工注射接種條銹混合病菌（條中32和條中33），以輝縣紅作為感病對照并種植感染行。待輝縣紅充分發(fā)病后，按反應(yīng)型0～4六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性。

（4）成株期葉銹病鑒定：供試材料成株期葉銹病的鑒定參照《小麥抗病蟲性評價(jià)技術(shù)規(guī)范》第2部分《小麥抗葉銹病評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，以輝縣紅作為感病對照并種植感染行，待輝縣紅充分發(fā)病后，按反應(yīng)型0～4六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病性。

1.2.3熒光原位雜交首先參照Dolezel等[8，9]的方法，稍作改動(dòng)，獲得根尖有絲分裂中期染色體制片;然后利用略微調(diào)整的寡核苷酸探針套[10]進(jìn)行原位雜交，在同時(shí)進(jìn)行寡核苷酸探針套FISH和GISH時(shí)，將pSc119.2-1的修飾改為TAMRA，以便與綠色基因組探針區(qū)別。并參考Zhuang等[11]描述的FISH程序，在雜交液中額外加入黑麥基因組DNA探針2.5μL和YN15基因組DNA1.7μL作為封阻。原位雜交時(shí)，在105℃加熱1min，取出后迅速置于-20℃冰乙醇10min以上;期間將制片置于70%乙醇+NaOH中，24℃變性6min，迅速依次置于70%、95%、100%乙醇，各脫水3min，用吸耳球吹干;雜交液和片子均變性完成后，將雜交液滴到蓋玻片的分裂相上，于37℃恒溫箱雜交6h以上，復(fù)染并鏡檢。

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藝性狀調(diào)查及抗病性鑒定

在六倍體小黑麥20090148與多個(gè)普通小麥材料復(fù)合雜交后代中，篩選到綜合表現(xiàn)較好的四份材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，對其進(jìn)行田間成株期農(nóng)藝性狀調(diào)查。四份材料平均株高最高的為134-5-1，最低的為127-12-2，株型均為中間型，且有芒，穗型分為長方穗、棍棒穗和圓錐穗三種類型，除134-5-1外均抗倒伏（圖1和表1）。

間白粉病、田間條銹病及田間葉銹病均表現(xiàn)免疫、高抗或中抗，可以作為抗病材料選育的種質(zhì)資源。

2.2細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

本研究利用改進(jìn)的染色體原位雜交技術(shù)，通過一次細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)獲得GISH與FISH兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，不僅極大地優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)效率，而且可以明確所鑒定材料中外源黑麥染色體的具體同源群、核型以及普通小麥的染色體核型。

結(jié)果（圖3）顯示，四份小黑麥種質(zhì)系材料的染色體數(shù)目均為2n=42條，其中127-12-2、134-5-1和125-3-1中未檢測到較大片段外源染色體，推測為小麥-黑麥漸滲系材料;131-2-3雖然染色體為42條，但是出現(xiàn)2D染色體被2R染色體取代的現(xiàn)象，為2D/2R代換系。

在細(xì)胞學(xué)結(jié)果獲得的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1的核型，見圖4。對種質(zhì)系131-2-3的小黑麥親本20090148、普通小麥親本SN224和濟(jì)麥22也分別進(jìn)行了原位雜交鑒定，構(gòu)建染色體核型，并將三個(gè)親本材料的染色體與131-2-3的染色體進(jìn)行核型比對，結(jié)果（圖5）顯示，除2R代換了普通小麥的2D染色體外，131-2-3中的6A、1B和2B染色體與三個(gè)親本染色體上的信號(hào)位點(diǎn)均出現(xiàn)了差異，表明131-2-3染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變異。

3討論與結(jié)論

小黑麥異染色體系的創(chuàng)制是黑麥中優(yōu)異基因向普通小麥轉(zhuǎn)移的主要途徑，它的創(chuàng)制為優(yōu)良種質(zhì)材料的選育及進(jìn)一步明確抗病來源及基因定位創(chuàng)造了條件。作為重要的白粉病抗源，小黑麥異染色體系已經(jīng)被發(fā)掘出多個(gè)白粉病抗性基因。例如：最早在小麥-黑麥易位系品種Transec中發(fā)現(xiàn)的Pm7基因，來自黑麥Rosen;攜帶位于1RS上的Pm8基因的易位系被廣泛種植;利用X射線處理得到的1AL/1RS易位系A(chǔ)migo，含有位于1RS上的Pm17基因以及最早在6BS/6RL易位系MIP6中發(fā)現(xiàn)的Pm20基因[12]。

同時(shí)，對于黑麥條銹病抗性基因的挖掘也是從選育小黑麥異染色體系開始的。已正式命名的小麥條銹病抗性基因中，Yr9基因[13]源于德國黑麥Petkus，此外，2010年趙毓將小麥-奧地利黑麥雙二倍體與阿勃6B缺體系雜交，篩選出了對白粉病和條銹病皆免疫的6R/6A代換系[14];2011年，張懷瓊等選育了高抗條銹病的小麥-黑麥6B/6R易位系，確定條銹病抗性來自6R易位片段[15];2013年，雷孟平在小麥-非洲黑麥雙二倍體與小麥雜交后代中篩選出免疫條銹病的6R/6D代換系[16]，綜合以上材料選育的結(jié)果，可以說明6R染色體上可能攜帶新的條銹病抗性基因。

此外，葉銹病抗性基因Lr45是在一個(gè)日本小麥-黑麥T2AS-2RS·2RL易位系中被發(fā)現(xiàn)的，來自黑麥Petkus，位于2RS上，是我國小麥葉銹菌的有效抗性基因，尚未發(fā)現(xiàn)對Lr45基因有毒性的葉銹菌株，在小麥育種中具有很大的應(yīng)用潛力。

通過染色體工程和基因工程等方法對小黑麥異染色體系進(jìn)行改良選育優(yōu)良材料并研究黑麥染色體抗性基因，對于拓寬小麥的基因資源，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種起著至關(guān)重要的作用。本研究通過表型鑒定及細(xì)胞學(xué)檢測的手段，獲得了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1四份優(yōu)異小黑麥異染色體系材料，可用于進(jìn)一步創(chuàng)制優(yōu)良育種材料。

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