潘瓊玉 田麗波 商桑 鄒凱茜 周萌萌 朱國鵬 曾麗萍

摘 要： 為了建立高頻的苦瓜離體再生體系，為苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)基礎(chǔ)，篩選了最適消毒方法和外植體類型。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度激素組合，篩選最適于苦瓜不定芽誘導(dǎo)、伸長和生根的培養(yǎng)基。最佳的消毒方法為：用水浸泡去殼的種子15 min，在超凈工作臺中用75%酒精浸泡30 s后再用4% NaClO浸泡6 min，用無菌水沖洗4～5遍，污染率為0，發(fā)芽率為98%;最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA，愈傷組織密度為0.79 g·cm-3，不定芽的分化率為39%，最佳外植體為下胚軸（12 d），誘導(dǎo)率為41%;最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA;最佳的生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1 IBA，移栽存活率為74%。初步建立了苦瓜離體再生體系。

關(guān)鍵詞： 苦瓜;再生體系;離體培養(yǎng);愈傷組織

In vitro regeneration system of bitter melon

PAN Qiongyu， TIAN Libo， SHANG Sang， ZOU Kaixi， ZHOU Mengmeng， ZHU Guopeng， ZENG Liping

（College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China，）

Abstract： In order to establish the high-frequency in vitro regeneration system of bitter melon， and provide technical basis for the genetic transformation of bitter melon， the optimal disinfection method and explant type were screened. MS medium was used as the basic medium， and added different concentrations of hormones. The most suitable medium for adventitious bud induction， elongation and rooting of bitter melon were selected. The best disinfection method was： soaking the shelled seeds in water for 15 min， 75% alcohol for 30 s in the ultra-clean workbench， 4% NaClO for 6 min， and rinse with sterile water for 4-5 times. The germination rate reached 98% without any pollution. The best callus induction medium is MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA. The callus density was 0.79 g·cm-3， and the adventitious bud differentiation rate was 39%. The optimal explant was hypocotyl （12 d）with duction rate 41%. The best proliferation medium is MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA. The best rooting medium is MS+0.1 mg·L-1 IBA. The transplanting survival rate was 74%. An in vitro regeneration system of bitter melon was established.

Key words： Bitter melon; Regeneration system; In vitro culture; Callus

苦瓜（Momordica charantia L.）為葫蘆科苦瓜屬一年生攀援狀柔弱草本植物，苦瓜性味甘苦寒涼、無毒，具有清熱解毒、補腎陽、祛寒濕、降血糖[1]、抗菌、抗腫瘤、抗病毒[2]等藥用功效，是一種食藥兼用的植物，在全世界廣泛種植，也已成為海南省的支柱蔬菜種類之一。但苦瓜常規(guī)育種的難度大、周期長、遺傳性狀不穩(wěn)定，而苦瓜基因組測序已經(jīng)完成[3]，利用分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種、基因編輯育種或設(shè)計育種已經(jīng)成為可能，遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立對種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種培育非常重要，而再生體系的建立是這些工作的基礎(chǔ)，也是目前研究的熱點，且離體再生能縮短植物的生長周期，固定雜種優(yōu)勢，其再生無菌苗不帶任何病菌。

目前，國內(nèi)外做過許多針對苦瓜的研究，主要集中在雜種優(yōu)勢利用、栽培技術(shù)以及近年來對其藥用性的研究。而苦瓜的再生體系這方面開始研究的時間比較晚，且效果不顯著，苦瓜外植體易于誘導(dǎo)出愈傷組織而難以分化出再生芽。而且，不同研究人員的試驗結(jié)論差異較大，高濃度的6-BA不利于叢生芽的伸長，但一定濃度的IAA和6-BA的組合配比對叢生芽的誘導(dǎo)有促進作用[4]。馮銳等[5]單獨用3.0 mg·L-1的KT時，叢生芽增殖效果為其他的4.9倍，且苗健壯，長勢好。還有用噻苯?。═DZ）對苦瓜叢生芽進行誘導(dǎo)的[6-9]。Tang[10]發(fā)現(xiàn)單獨用BAP能誘導(dǎo)芽分化。有用CSH和TDZ搭配加在MS中誘導(dǎo)苦瓜外植體為子葉的愈傷組織發(fā)芽[11]。還有用2，4-D對外植體進行愈傷誘導(dǎo)的試驗[12-13]。在用外植體直接誘導(dǎo)出叢生芽的階段，植物苗齡也是影響不定芽誘導(dǎo)能否成功的重要因素之一[14]。王國莉等[15]用3個不同生長階段的苦瓜無菌苗進行試驗，結(jié)果證明，10 d前后苗齡是誘導(dǎo)子葉節(jié)叢生芽的最適時期。

當(dāng)前已有的離體培養(yǎng)再生體系并不適于所有的苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化，建立適宜的苦瓜離體再生體系十分必要，這不僅具有一定難度，還具有一定的創(chuàng)新性。筆者對苦瓜的離體培養(yǎng)和植株再生條件進行研究，以期為建立苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘海研二號苦瓜，由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院苦瓜課題組提供;MS培養(yǎng)基配方：蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1，pH 5.8～6.0。試驗于2017年11月至2018年6月在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院品種改良試驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為27～29 ℃，光照強度為2 000 Lx，每日光照16 h，黑暗8 h。

1.2.2 種子無菌萌發(fā) 用以下3種消毒方式：（1）將種子去殼，用水浸泡15 min，在超凈工作臺中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡4 min，用無菌水沖洗4～5遍;（2）將種子去殼，用水浸泡15 min，在超凈工作臺中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡6 min，用無菌水沖洗4～5遍;（3）將種子去殼，用水浸泡15 min，在超凈工作臺中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡8 min，用無菌水沖洗4～5遍。每個方法3次重復(fù)。將消毒好的種子接種到MS培養(yǎng)基中，每瓶1粒，各接20瓶（待確定最佳的消毒方式后，接種時每瓶接種3～5粒），放入培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，種子露白后移到光下。7 d后統(tǒng)計發(fā)芽率和污染率，比較各種消毒方法的效果和無菌苗的生長情況，得出最佳的消毒方式。

1.2.3 外植體的取材 待接種6～7 d后（苦瓜苗長勢如圖1-a），將無菌苗子葉（外植體1）和下胚軸（外植體2）切下，下胚軸取4～5 mm，子葉取5 mm×5 mm作為外植體;待接種12 d后（苦瓜苗長勢如圖1-b），將無菌苗下胚軸（外植體3）和頂芽（外植體4）切取4～5 mm，用手術(shù)刀切取新葉和真葉，輕輕刮去生長點作為外植體。

1.2.4 愈傷組織及不定芽的分化 每種外植體取20個，將外植體頂端朝上，插在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。MS+（1、1.5、2、2.5、3） mg·L-1 6-BA+（0.01、0.02） mg·L-1 IBA配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表1），14 d內(nèi)統(tǒng)計各愈傷組織的啟動時間，28 d后記錄愈傷組織的形成率和愈傷組織質(zhì)地。選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)了30 d后的愈傷組織接種到最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)14 d后記錄芽原基分化情況。30 d后，統(tǒng)計不定芽分化率和不定芽數(shù)量。

愈傷組織形成率/%=形成愈傷組織的葉柄數(shù)/接種的葉柄外植體總數(shù)×100;

愈傷組織密度= 20 塊愈傷組織的鮮質(zhì)量（g）/20 塊愈傷組織的體積（cm3）。

愈傷組織體積的測量方法為：每一批取20塊愈傷組織浸入到200 mL 的無菌水中，溢出水的體積即為20 塊愈傷組織的體積。

不定芽的分化率/%=分化出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100。

1.2.5 增殖培養(yǎng) 將已長出大量不定芽的愈傷組織切成約4 mm×4 mm大小，轉(zhuǎn)接到MS+（1、1.5） mg·L-1 6-BA+（0.005、0.01） mg·L-1 IBA和不加激素的MS增殖培養(yǎng)基中，比較不同濃度激素對不定芽的影響，2周后記錄不定芽伸長率和伸長量。

1.2.6 生根培養(yǎng) 以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.01、0.02 mg·L-1 IBA，探索無機鹽和不同濃度IBA對不定根誘導(dǎo)的影響，15 d后分別統(tǒng)計不定根的發(fā)生率和數(shù)目，選出最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.7 煉苗試驗 將根長2.5～3.0 cm的再生苗除去瓶蓋，加入剛好能沒過培養(yǎng)基的水，放在室溫下培養(yǎng)2～3 d，將再生苗取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有無菌土（V營養(yǎng)土∶V基質(zhì) = 3∶1）的定植盆中，澆透定根水，再在室溫中暗培養(yǎng)3 d。3 d后移至正常光下，每天澆1次水，15 d后統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的無菌萌發(fā)

由表2可知，方法2的發(fā)芽率和污染率都顯著好于其他2種方法。3種消毒方法的發(fā)芽率都較高，第2種方式發(fā)芽率發(fā)到98%，污染率為0，是本次試驗中最佳的消毒方式。第1種方法雖然發(fā)芽率也高達93%，但是消毒不徹底;第3種方法雖然消毒較徹底，但消毒過度，傷害到種子的胚，造成發(fā)芽率降低。

2.2 不同外植體類型對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表3可以看出，外植體1和外植體2較難誘導(dǎo)出不定芽。外植體3和外植體4都能誘導(dǎo)出不定芽，而外植體3（圖1-c）誘導(dǎo)率最高，如圖1-d，為41%，且顯著高于其他外植體。因為前期處理外植體時，已經(jīng)把芽點都處理干凈，誘導(dǎo)得到的芽14 d左右才能形成，長得慢;普通的芽5 d左右便形成了，長得快，可以區(qū)別開來。所以，外植體3為本次試驗的最佳外植體。

2.3 不同激素類型、濃度配比對不定芽的誘導(dǎo)試驗

將本次試驗中選出的最佳外植體下胚軸（12 d）接種到由不同濃度激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，一定時間記錄愈傷組織的分化情況。從表4中可以看出，隨著6-BA濃度的提高，愈傷組織啟動時間越快，愈傷組織的形成率也隨著提高。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1、IBA為0.01 mg·L-1時，愈傷組織密度達到最高，為0.79 g·cm-3，愈傷組織比較致密。

后續(xù)培養(yǎng)可看到愈傷組織分化出密密麻麻的芽原基，繼代培養(yǎng)14 d左右可形成小苗，再過14 d轉(zhuǎn)接到不定芽伸長培養(yǎng)基中。由表2得出，當(dāng)6-BA為2.5 mg·L-1、IBA為0.01 mg·L-1時，不定芽的分化率為39%，不定芽數(shù)目較高，為7.1個。7號培養(yǎng)基的愈傷組織密度、不定芽分化率、不定芽數(shù)都顯著高于5號培養(yǎng)基。因此，7號誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA是最適合苦瓜外植體3愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

2.4 不定芽的伸長

從表5可知，提高6-BA濃度不利于不定芽的伸長，而適當(dāng)?shù)靥岣逫BA濃度，有利于不定芽的伸長。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1、IBA為0.005 mg·L-1時，不定芽伸長率為90%，芽平均長度為0.87 mm。較低的激素有利于不定芽的生長，但配比不合適的培養(yǎng)基會讓愈傷組織出現(xiàn)玻璃化和褐化，造成不定芽的死亡。且3號的不定芽伸長率和芽均長都顯著高于其他培養(yǎng)基。因此，最適合苦瓜不定芽伸長的培養(yǎng)基是3號MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA。

2.5 生根培養(yǎng)

從表6中可以看出，隨著無機鹽濃度的降低，無菌苗的生根率和平均根數(shù)升高，但是存活率降低。所以，MS培養(yǎng)基比較有利于無菌苗的存活。隨著IBA濃度提高，無菌苗的生根率和平均根數(shù)、移栽成活率降低，配合MS的使用，當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時，無菌苗的生根率、平均根數(shù)和移栽成活率達到最高，分別為42%、5.67條、74%。1號生根培養(yǎng)基的平均根數(shù)顯著高于2號、4號，移栽成活率顯著高于2號、3號。所以，1號生根培養(yǎng)基MS+0.1 mg·L-1 IBA是本次研究中最適合苦瓜無菌苗生根和移栽的培養(yǎng)基。

2.6 試管苗移栽

當(dāng)試管苗的根長達到2.5～3.0 cm，如圖1-e，進行煉苗移栽。每天澆1次水，2周后統(tǒng)計成活率，為74%，圖1-f即為成活。

3 討論與結(jié)論

起始外植體材料是影響植物離體再生的重要因素。外植體再生能力與外植體取材部位、切割方法、外植體的年齡以及材料的極性等因素相關(guān)[16]。外植體材料需具有大量再生能力強的細胞群存在，才能在生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)下脫分化。羅燕華的試驗表明苦瓜的幼葉、下胚軸和愈傷組織誘導(dǎo)分化很難，而子葉節(jié)卻可以直接誘導(dǎo)出叢生芽[4]。真葉、上下胚軸等外植體愈傷組織生長速度比較緩慢[4]，而子葉、下胚軸和幼根的愈傷組織的生長速度快[17]。在西瓜中，很多組織和器官都能作為西瓜的外植體，比如子葉、莖尖、幼葉、頂芽等，但即使是在同一植株上，其誘導(dǎo)率也存在差異[18]。本研究的最佳外植體為外植體3，即苗齡為12～14 d的下胚軸，和羅燕華[4]的結(jié)果不同，可能與采用的下胚軸的生長狀態(tài)不同有關(guān);用子葉、頂芽和下胚軸（苗齡為6～8 d）沒有誘導(dǎo)出不定芽，原因可能是外植體內(nèi)源激素與培養(yǎng)基的激素配比不合適，而且不同外植體在誘導(dǎo)不定芽的能力上也是有區(qū)別的。

植物組培中的一個很重要的條件是植物培養(yǎng)基種類和成分。培養(yǎng)基的成分與植物是否能成功生長有直接關(guān)系。生長素和細胞分裂素能很好地促進叢生芽的發(fā)生[5]。影響植物愈傷組織的形成的一個重要因素是不同的激素組合配比。王國莉等[15]在2組激素組合MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA和MS+2.0 mg·L-1 玉米素（ZT）+0.1 mg·L-1 萘乙酸（NAA）中，3種基因型苦瓜的誘導(dǎo)率都是最高的，每10個外植體得到30個左右的叢生芽。潘紹坤等[19]研究苦瓜再生植株時發(fā)現(xiàn)，加入IAA和吲哚丁酸（IBA）的每個處理的不定芽再生率都很高。筆者發(fā)現(xiàn)，2.5 mg·L-1 6-BA配合0.01 mg·L-1 IBA可以使‘海研二號苦瓜的下胚軸（12 d）愈傷組織不定芽分化率達到最高。高濃度的6-BA雖然對愈傷組織的誘導(dǎo)效果很好，對不定芽的分化起關(guān)鍵性作用，但也造成叢生芽不易伸長、畸形和玻璃化的現(xiàn)象。而且轉(zhuǎn)接次數(shù)越多，培養(yǎng)時間越長，苦瓜也可能出現(xiàn)基因變異，會影響后續(xù)的再生能力。以上結(jié)果表明了作物的種類和基因型、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度都是影響外植體再生的重要因素。

苦瓜具有很高的食用和藥用價值，不論是在品質(zhì)改良，或是提高抗性等方面，苦瓜都有著很大的潛力。而常規(guī)育種技術(shù)難以獲得的新種質(zhì)，可以利用分子育種改良品質(zhì)、提高抗病、抗逆或抗蟲性，獲得新的優(yōu)良品種，這將會為苦瓜的遺傳育種開辟新的道路。所以，苦瓜的離體再生體系的研究將會加速育種進程。而與其他葫蘆科的植物相比，由苦瓜外植體誘導(dǎo)不定芽的過程還是十分困難，不定芽的誘導(dǎo)率為39%，甜瓜再生率在45%[20]、67%[21]、88.67%[22]，西瓜為83.32%[23]、87.78%、82.78%和 86.11%[24]，黃瓜為50.0%、56.3%[25]、96.2%[26]，南瓜為19.8%和20.1%[27]、64.5%[28]，且不定芽畸形和玻璃化等不正?，F(xiàn)象出現(xiàn)頻繁。如何進一步提高苦瓜不定芽的誘導(dǎo)率，解決不定芽的不正?，F(xiàn)象，建立一個穩(wěn)定高效的再生體系，是值得研究的問題。

通過嚴(yán)格的無菌操作、對苦瓜外植體培養(yǎng)條件的篩選和改善、觀察和統(tǒng)計愈傷組織和不定芽伸長情況及不定芽數(shù)量，初步建立了苦瓜離體再生體系，為今后苦瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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