王艷紅,胡丹丹,潘雪靜

(德州市陵城區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 德州 253500)

黃曲霉毒素污染是深受食品和農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)關(guān)注的問(wèn)題，小麥等糧食作物，在濕熱條件下儲(chǔ)藏時(shí)容易受到黃曲霉污染，產(chǎn)生黃曲霉毒素，人和動(dòng)物攝入或皮膚接觸被黃曲霉毒素污染的糧食時(shí)，會(huì)引發(fā)多種中毒癥狀甚至死亡[1]。黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次生有毒代謝產(chǎn)物，是一類具有較強(qiáng)毒性和致癌性的二氫呋喃香豆素衍生物，其中，黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，簡(jiǎn)寫(xiě)為 AFTB1)的致癌性最強(qiáng)，是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要因素之一[2]。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017中規(guī)定黃曲霉毒素B1在小麥等谷物中最大限量為5.0 μg/kg[3]。近年來(lái)，由于全球的氣候變暖，小麥等谷物被黃曲霉毒素侵害的程度及范圍均呈上升趨勢(shì)[4]，因此，開(kāi)發(fā)快速高效的分析方法檢測(cè)糧食作物中黃曲霉毒素B1對(duì)于保障糧食安全有著十分重要的意義。

常見(jiàn)的黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法主要為薄層色譜法(TLC)[5-6]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-11]。薄層色譜法和酶聯(lián)免疫法操作簡(jiǎn)單，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，定量效果較差，不適用為最終確證；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法需要配備價(jià)格昂貴的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，檢測(cè)成本較高，應(yīng)用受到一定限制。高效液相色譜法(熒光檢測(cè))是黃曲霉毒素B1分析最常用的分析方法，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，一方面采用了光化學(xué)衍生器進(jìn)行柱后衍生，既增強(qiáng)了AFTB1的檢測(cè)靈敏度，又避免了化學(xué)衍生過(guò)程帶來(lái)的試劑污染；另一方面改進(jìn)了AFTB1的提取過(guò)程和固相萃取洗脫過(guò)程，AFTB1的回收率可提升至98.3%。與傳統(tǒng)的高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素B1相比，本方法快速高效、重現(xiàn)性好、檢出限更低、回收率更高、有機(jī)溶劑消耗少，為后續(xù)黃曲霉毒素 B1分析檢測(cè)的研究提供了有力參考，適用于小麥等糧食作物中黃曲霉毒素B1的批量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：2μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)；乙腈、甲醇：色譜純，F(xiàn)isher公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱：3mL，北京康源泰博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器)；XDB-C18色譜柱，5μm×4.6mm×250mm；FA2004萬(wàn)分之一天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；柱后光化學(xué)衍生器：北京華安麥科生物科技有限公司；FSH-2H可調(diào)高速勻漿機(jī)：金壇區(qū)西城新銳儀器廠；TDZ5-WS離心機(jī)：長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；氮吹儀。

1.3 方法

1.3.1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液(2μg/mL)1mL轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成濃度為200ng/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5，25，100，250，500，1000，2000μL 至 10 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容，得到濃度點(diǎn)為0.1，0.5,2.0,5.0,10.0,20.0,40.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取均勻的小麥試樣5 g于50 mL具塞離心管中，加入乙腈-水溶液(84∶ 16,v/v)25.0 mL進(jìn)行提取，渦旋混勻，10000 r/min均質(zhì)3min，在10000 r/min下離心5min，取上清液備用。

取15 mL上清液加入30 mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，移取15mL稀釋液，過(guò)免疫親和柱凈化，流速不超過(guò)1mL/min，確保黃曲霉毒素B1完全被吸附。用10mL水分兩次淋洗免疫親和柱以除去雜質(zhì)，抽干小柱，棄去全部流出液。加入3mL甲醇洗脫樣品，收集全部流出液，流出液經(jīng)N2吹干，準(zhǔn)確加入1.0 mL色譜級(jí)甲醇復(fù)溶樣品，混勻30 s，過(guò)0.22μm濾膜后待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

進(jìn)樣量20μL；柱溫40℃；流速1mL/min；流動(dòng)相：甲醇∶ 水=55∶ 45；激發(fā)波長(zhǎng)：360nm，發(fā)射波長(zhǎng)：440nm；分析時(shí)間為15min。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗脫液體積的選擇

文獻(xiàn)中AFTB1經(jīng)免疫親和柱凈化后，只加入1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，但研究發(fā)現(xiàn)，加入1 mL甲醇洗脫后上機(jī)測(cè)定，AFTB1的回收率僅為80%左右。因此考慮，1mL甲醇并不能完全洗脫免疫親和柱中吸附的AFTB1。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分3次向同一待洗脫的免疫親和柱中加入1mL甲醇進(jìn)行洗脫，每次均抽干小柱，分別收集三次洗脫液進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第一次洗脫后AFTB1的回收率為80%，第二次洗脫后AFTB1的回收率為16%，第三次洗脫后AFTB1的回收率才幾乎為0。因此本文采用洗脫液體積為3mL，收集到的洗脫液經(jīng)N2吹干后，再準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇復(fù)溶樣品，待HPLC分析。

2.2 提取溶液的選擇

GB 5009.22-2016中給出了兩種提取溶液：甲醇-水和乙腈-水，本文以此為突破點(diǎn)，分別研究了甲醇-水系列(甲醇的體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、84%和90%)和乙腈-水系列(乙腈的體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、84%和90%)作為提取溶液時(shí)黃曲霉毒素B1的回收情況，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)V(乙腈)∶ V(水)=84∶ 16作為提取溶液時(shí)提取效率最好，黃曲霉毒素B1的回收率最高，可達(dá)到98.3%，因此本文選擇V(乙腈)∶ V(水)=84∶ 16作為最優(yōu)提取溶液。

表1 提取液對(duì)黃曲霉毒素B1回收率影響

表1(續(xù))

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

按優(yōu)化后的方法對(duì)已配置好的AFTB1準(zhǔn)工作曲線溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，AFTB1含量為橫坐標(biāo)，繪制校正曲線(如圖1)。AFTB1在0.1～40.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系，線性回歸方程y=1037582x-126713，相關(guān)系數(shù)r2=0.9999，方法檢出限為0.02 μg/kg(S/N=3)。

圖1 AFTB1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

在小麥樣品中分別加入3個(gè)水平的AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，按優(yōu)化后的處理方法每個(gè)水平平行處理6次，測(cè)定樣品中AFTB1濃度(圖2為小麥試樣色譜圖，圖3 為小麥試樣加標(biāo)色譜圖)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1，AFTB1的回收率為92.0%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<3%。

圖2 小麥色譜圖

圖3 小麥(加標(biāo))色譜圖

表2 樣品中加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種固相萃取-高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)的分析方法測(cè)定小麥中黃曲霉毒素B1的含量，通過(guò)改進(jìn)AFTB1的提取過(guò)程和固相萃取洗脫過(guò)程，優(yōu)化了樣品的前處理。在最優(yōu)條件下，AFTB1在0.1～40.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限可達(dá)到0.02μg/kg(S/N=3)，三個(gè)水平的加標(biāo)回收率在92.0%～98.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<3%。本研究檢出限更低、回收率更高，適用性強(qiáng)，為小麥等糧食作物中黃曲霉毒素 B1污染情況的監(jiān)測(cè)提供了準(zhǔn)確可靠的依據(jù)。