趙留濤，韓志霞，魏紅艷，韓冰倩，陳晶晶，高梓晴，李憲斌，李江龍，袁之潤，陳五常，吳春麗,4*

（1.鄭州大學藥學院，河南鄭州450001；2.商丘愛己愛牧生物科技股份有限公司，河南虞城476300；3.鄭州愛己愛牧生物技術有限公司，河南鄭州450001；4.鄭州市新型獸藥制劑創(chuàng)新重點實驗室，河南鄭州450001）

北芪五加顆粒處方由黃芪和刺五加兩味藥材組成，其中具有益氣健脾、補腎安神功效[1]，用于提高禽的機體自身免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果，廣泛用于畜禽養(yǎng)殖。 現(xiàn)代藥理學研究表明黃芪具有顯著的免疫增強作用[2-3]，主要化學成分為多糖類[4]、皂苷類[5]及黃酮類[6]等，黃芪甲苷是黃芪提高畜禽機體免疫力的主要活性成分[7]，是控制黃芪及其制劑質(zhì)量的重要指標，因此將其做為控制北芪五加顆粒質(zhì)量的指標。 本文研究建立了高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測定北芪五加顆粒中黃芪甲苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

儀器： Waters e 2695 型高效液相色譜儀，Waters 2424 蒸發(fā)光檢測器，Empower 化學工作站（美國沃特世公司）；METTLER TOLEDO AB135-S萬分之一天平（瑞士梅特勒- 托利多公司）；黃芪甲苷對照品，批號：1521-201003，購于中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈（色譜級）；純化水；其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈- 水(37：63)為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器。 理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不低于3500。

2.2 溶液配置

2.2.1 黃芪甲苷對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量， 加甲醇定容制成每1 ml 中含0.2 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取北芪五加顆粒適量，研細，精密稱定5.0g，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30 min，放置冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足失重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25ml，置水浴上蒸干，殘渣加水20ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨試液20ml 洗滌，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水20ml 洗滌，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 依據(jù)處方中藥材的比例， 按標準制法制備缺黃芪藥材的陰性對照樣品，按2.2.2 項操作制備樣品陰性對照溶液。 按照上述色譜條件，分別將對照品溶液和陰性對照品溶液注入色譜儀測定，結果陰性樣品色譜在與黃芪甲苷峰相應的保留時間附近無干擾峰檢出。

2.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液3 μl 和6 μl 及供試品溶液3 μl，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法對數(shù)方程計算，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性照上述2.1 項下色譜條件，分別精密吸取陰性對照溶液10μL、供試品溶液10 μL、對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，陰性對照溶液在黃芪甲苷對照品相應的保留時間處無干擾，見圖1。

2.4.2 線性關系考察 精密取黃芪甲苷對照品適量， 制成5 個不同濃度， 分別為0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.20 mg/ml、0.50 mg/ml、1.00 mg/ml的對照品溶液，按2.1 項操作，分別測定峰面積，然后以峰面積積分值為縱坐標，黃芪甲含量為橫坐標繪制標準曲線， 計算線性回歸方程，Y=1.57e+000X+2.29e+000，相關系數(shù)r=0.9993。試驗結果見表1。 結果表明黃芪甲苷濃度在0.05～1.00 mg/ml 范圍內(nèi)，呈線性關系，結果見圖2。

圖1 專屬性考察色譜圖

圖2 黃芪甲苷標準曲線

2.4.3 精密度試驗 使用高效液相色譜儀， 連續(xù)進樣6 次， 每次進樣量為3 μL 黃芪甲苷對照品溶液，測得黃芪甲苷峰面積RSD 為0.93%，結果表明，所建立方法的精密度良好。

2.4.4 重復性 取同一供試品，按2.2.2 項操作制備方法制備6 份供試液，分別進樣檢測黃芪甲苷峰面積，并分別計算黃芪甲苷含量和含量的相對標準偏差，RSD 為2.50%，結果顯示，所建立方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0、1、2、3、4、5 小時時測定黃芪甲苷峰面積、 并分別計算含量和含量的相對標準偏差，RSD 為2.10%，表明5 小時內(nèi)供試品溶液中黃芪甲苷在5 小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 回收率 取同一批號已知含量供試品 （黃芪甲苷含量0.5802 mg/g）20 g，研細，混勻，取2.5g，精密稱定，共取6 份，各加入黃芪甲苷對照品儲備液1 ml， 按2.2.2 項操作制備方法制備供試品溶液，按2.3 項操作進樣量，測的黃芪甲苷峰面積并計算其含量，再算出加樣回收率，測得平均回收率為101.93%，RSD 為2.95%，表明方法準確度良好，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗（n=6）

2.4.7 樣品含量測定取20110201、20110202 和20110203 三個批號供試品， 按照2.2.2 項下的方法制備供試品溶液并測定， 計算黃芪甲苷的含量，含量分別為0.48 mg/g、0.50 mg/g、0.50 mg/g。

3 討論

3.1 色譜柱選擇與耐用性試驗T3 色譜柱是基于超純硅膠基質(zhì)的反相C18 色譜柱，在保留和分離強極性化合物使用效果好，而且在較寬的pH 值范圍內(nèi)保持良好性能。 同常規(guī)C18 色譜柱相比，T3 色譜柱具有不同的分離選擇性和相對更好的保留性能。 更適合極性較大的化合物。 黃芪甲苷是自黃芪中提取分離的單體化合物，是皂苷類成分的一種極性較大化合物，所以用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱進行質(zhì)量研究。 同時C18色譜柱做耐用性理論塔板等性能也較好，在以后的含量測定中也可使用。

3.2 流動相的確定 參考文獻[8-9]流動相乙腈-水(32：68)條件下調(diào)整流動相比例，最終確定流動相比例為乙腈- 水(37：63)。

3.3 蒸發(fā)光檢測器條件的優(yōu)化[10]

3.3.1 氣體壓力的優(yōu)化 考察氣體壓力分別為25psi、30psi、35psi，結果顯示氣壓大小影響霧化，氣壓增大信噪比也增大，但峰面積減小，所以最終定氣壓25psi。

3.3.2 漂移管溫度的優(yōu)化 分別考察漂移管溫度為55℃、60℃、65℃、70℃條件，結果表明黃芪甲苷峰各項指標在漂移管溫度為60℃時效果較好，因此設定漂移管溫度為60℃。

4 結論

試驗研究證明HPLC-ELSD 法測定北芪五加顆粒中黃芪甲苷的含量，在上述試驗條件下，黃芪甲苷分離度良好，保留時間合適，方法學考察表明該方法專屬性、重復性、精密度良好，能夠準確測定出黃芪甲苷的含量，從而有效控制北芪五加顆粒的質(zhì)量。