張佳文 于 雁 張 薇 曹京燕 羅 雯 尚利華

小細(xì)胞肺癌約占肺癌發(fā)病率的20%，由于其腫瘤倍增周期短、侵襲性高，所以5年生存率低[1-2]。早期診斷是改善小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)鍵，因此，如何提高早期診斷水平已成為肺癌防治的緊迫任務(wù)，目前建立無(wú)創(chuàng)性的診斷方法是腫瘤篩選的研究熱點(diǎn)。代謝組學(xué)是一類(lèi)新興學(xué)科，它沿用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路，以生物體液為研究對(duì)象，檢測(cè)機(jī)體出現(xiàn)病理變化時(shí)其代謝產(chǎn)物的變化，并通過(guò)定量分析鑒定相關(guān)標(biāo)志物，利用此技術(shù)可以預(yù)測(cè)疾病發(fā)生發(fā)展或監(jiān)測(cè)疾病對(duì)干預(yù)的反應(yīng)，可以為疾病的早期診斷和療效評(píng)估提供幫助[3-4]。本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-TOF/MS)對(duì)小細(xì)胞肺癌患者與健康志愿者血清進(jìn)行定性定量分析，通過(guò)對(duì)比小細(xì)胞肺癌患者和健康人群的代謝輪廓變化，將兩組進(jìn)行區(qū)別，并進(jìn)一步進(jìn)行成分分析，尋找潛在的腫瘤標(biāo)志物。同時(shí)檢測(cè)局限期、廣泛期小細(xì)胞肺癌患者血清中的代謝物變化，用以區(qū)別肺癌的不同分期。

1 方法與結(jié)果判定

1.1 試驗(yàn)方法

1.1.1 血漿樣本采集 收集2012年9月—2013年7月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的小細(xì)胞肺癌患者血漿樣本44例，其中男性28例，女性16例，年齡34～73歲。進(jìn)一步對(duì)患者按照疾病分期分組，其中小細(xì)胞肺癌局限期(LD)28例，廣泛期(ED)16例。以上患者均經(jīng)CT引導(dǎo)下穿刺病理活檢或支氣管鏡下組織活檢后進(jìn)行病理診斷確診。健康人群血樣(NC)同時(shí)期收集于哈爾濱工業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心(已簽署知情同意書(shū))，共計(jì)50例，既往無(wú)腫瘤病史，體檢結(jié)果均無(wú)肺部疾病。均為清晨空腹血漿樣本。血漿樣本臨床資料如表1所示，兩組在年齡、性別等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 血清樣品的臨床信息Table 1 Pathological characteristics of blood samples

1.1.2 血漿樣本處理 血漿樣本室溫靜置后離心棄沉淀取上清液。分析時(shí)取30 μL血清加入120 μL甲醇，將混合液充分震蕩30 s搖勻。將混合液離心后取上清液100 μL裝入微量進(jìn)樣瓶，將微量進(jìn)樣瓶置于標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣瓶中進(jìn)行待檢測(cè)備用。標(biāo)本檢測(cè)流程：(1)液相色譜部分包括進(jìn)樣傳輸系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)以及分離系統(tǒng)；(2)質(zhì)譜部分包括離子源、質(zhì)量分析器、檢測(cè)器和記錄系統(tǒng)；(3)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)則是利用標(biāo)準(zhǔn)樣品校準(zhǔn)質(zhì)譜儀、設(shè)置色譜和質(zhì)樸的工作條件、數(shù)據(jù)的收集和處理以及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。超高效液相色譜條件C18柱(ACQUITY，50×2.1 mm，1.7 μL，美國(guó)Waters公司)。流動(dòng)相：A液0.1%甲酸水溶液，B液乙腈溶液。進(jìn)樣量5 μL，柱溫40℃，梯度洗脫，初始流動(dòng)相為10%B液，保持30 s后在35 min內(nèi)線性增加到98%B液，保持 2 min后再返回10%B平衡2 min；流速0.35 mL/min。具體洗脫條件見(jiàn)表2。質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)噴霧氣流量(脫溶劑氣流量高)600 L/h，錐孔氣流量50 L/h，電噴霧氣溫度300℃，離子源溫度120℃，錐孔電壓30 V，毛細(xì)管電壓3100 V，數(shù)據(jù)采集范圍m/z100～1000，質(zhì)荷比誤差限：0.5，噪音上限6.0。

表2 洗脫梯度Table 2 Gradient elution

1.2 結(jié)果評(píng)定

將分析所得的原始圖譜和數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZinfo2.0軟件進(jìn)行分析，采用主成分分析法(PCA)，最小二乘法-判別分析法(OPLS-DA)等方法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別。利用主成分分析法，得到Score-plot圖以觀察各組之間離散趨勢(shì)，討論樣本成分輪廓變化。利用OPLS-DA法檢測(cè)代謝結(jié)果的3D模型，得到表示預(yù)測(cè)能力的Q2(cum)及解釋能力的R2Y(cum)。對(duì)于所得結(jié)果，若R2Y接近1，Q2接近0.5，則模型的解釋及預(yù)測(cè)能力較好，同時(shí)Q2-intercept即其截距小于0則表示模型不存在過(guò)擬合的現(xiàn)象[5-6]。潛在血清標(biāo)志物根據(jù)反應(yīng)離子貢獻(xiàn)度(Variable importance in the projection，VIP)值、離子保留時(shí)間、質(zhì)荷比進(jìn)行篩選，同時(shí)結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。其中VIP值應(yīng)大于1，數(shù)值越大，則說(shuō)明變量與模型的相關(guān)性越大。

2 結(jié)果

2.1 小細(xì)胞肺癌患者與健康人群的代謝輪廓比較

為了更加細(xì)致的考察各樣本間的實(shí)質(zhì)差異，研究小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及疾病進(jìn)展過(guò)程中血清代謝成分變化與其相對(duì)應(yīng)的疾病情況的關(guān)系，首先采用MassLynx V4.1工作站中MarkerLynx軟件進(jìn)行色譜峰的識(shí)別匹配，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了提取和標(biāo)準(zhǔn)化處理。圖1、2分別為小細(xì)胞肺癌患者及正常健康人群的血清通過(guò)UPLC-TQ/MS分析所得的總離子流(TIC)圖。

圖1 小細(xì)胞肺癌血清負(fù)離子模式色譜圖Figure 1 The typical chromatogram of SCLC serum in negative model

圖2 健康對(duì)照組血清負(fù)離子模式色譜圖Figure 2 The typical chromatogram of normal control serum in negative model

利用EZinfo2.0軟件對(duì)包含小細(xì)胞肺癌及健康對(duì)照組圖譜信息的數(shù)據(jù)集進(jìn)行非監(jiān)督模式的PCA，得到一個(gè)PCA模型如圖3所示。其中小細(xì)胞肺癌患者與健康對(duì)照組呈分離趨勢(shì)。進(jìn)一步繪制score-plot圖觀察樣本離散程度，如圖4所示，小細(xì)胞肺癌組與健康對(duì)照組的血清輪廓有明顯差異，其中R2Y=0.723，Q2=0.647，同時(shí)R2Y-intercept=0.25，Q2-intercept=-0.21，這些參數(shù)均證明該結(jié)果有意義，同時(shí)模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

圖3 SCLC患者血清樣本與健康對(duì)照組血清樣本2D得分圖Figure 3 The 2D score plot of SCLC and controls

圖4 SCLC患者血清樣本與健康對(duì)照組血清樣本3D得分圖Figure 4 The 3D score plot of SCLC and controls

2.2 差異性代謝物成分分析

將三組血清中的所有小分子代謝物進(jìn)行聚類(lèi)分析，并通過(guò)HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)搜索差異物的精確質(zhì)荷比，對(duì)一些具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行了初步的成分鑒別。通過(guò)計(jì)算小細(xì)胞肺癌患者與健康對(duì)照組，小細(xì)胞肺癌局限期與小細(xì)胞肺癌廣泛期兩組樣品，提取得分圖中各數(shù)據(jù)點(diǎn)的坐標(biāo)值，分別對(duì)X、Y坐標(biāo)值進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05)，篩選出兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的化合物。現(xiàn)以Marker ID：4.99_464.3022為例。在對(duì)比不同分期的小細(xì)胞肺癌患者血樣代謝物差異時(shí)，測(cè)得該物質(zhì)保留時(shí)間Rt=4.99，[M+H]+=464.3022，VIP值=2.31。根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)該化合物分子中含有奇數(shù)個(gè)N原子，在誤差為5 ppm內(nèi)，可得分子式為C26H43NO6，進(jìn)一步在HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，認(rèn)為該化合物最有可能甘氨膽酸(Glycocholic Acid)。

對(duì)其他的潛在性生物標(biāo)志物應(yīng)用以上方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終共鑒定出與小細(xì)胞肺癌發(fā)生相關(guān)的生物標(biāo)志物10個(gè)，與小細(xì)胞肺癌進(jìn)展相關(guān)的生物標(biāo)志物10個(gè)。VIP最低為1.02，所有生物標(biāo)志物VIP值均大于1，對(duì)模型和樣本分類(lèi)均有較大貢獻(xiàn)，可以作為潛在的生物標(biāo)志物探討其生化意義。標(biāo)志物的詳細(xì)信息見(jiàn)表2、表3。

表2 小細(xì)胞肺癌患者與健康人群腫瘤代謝標(biāo)志物鑒定信息表Table 2 Potential biomarkers for SCLC and normal samples

Note：P<0.05；Group A.SCLC Samples；Group B.Normal Samples.

表3 不同分期小細(xì)胞肺癌患者腫瘤代謝標(biāo)志物鑒定信息表Table 3 Potential biomarkers for SCLC with different staging

Note：P<0.05；Group C：SCLC-LD Samples；Group D：SCLC-ED Samples.

經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，我們發(fā)現(xiàn)鑒定出的20種差異性成分包括6種溶血性磷脂酰膽堿、2種脂肪酸、4種氧化脂肪酸及甘油類(lèi)及氨基酸等幾大類(lèi)物質(zhì)。對(duì)比小細(xì)胞肺癌患者與健康人群的血清樣本，十八碳二烯酸(8(R)-HPODE)、亞麻酸、溶血性磷脂酰膽堿18∶0、溶血性磷脂酰膽堿15∶0、依泊二醇、溶血性磷脂酰膽堿18∶2(9Z，12Z)、溶血性磷脂酰膽堿18∶1(11Z)、溶血性磷脂酰膽堿O-18∶0在小細(xì)胞肺癌患者血清中升高，溶血性磷脂酰膽堿16∶0和磷脂酰乙醇胺(P-18∶0/0∶0)則顯示下降。另一方面，對(duì)兩種不同分期的小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行分組分析，差異成分為甘氨膽酸等10種物質(zhì)。其中甘氨膽酸、葡萄糖苷、精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸在小細(xì)胞肺癌局限期一組內(nèi)表達(dá)較高，但相反的是，十六碳二酸和依泊二醇則在小細(xì)胞肺癌廣泛期一組內(nèi)表達(dá)較高。

3 討論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，與健康人群相比，小細(xì)胞肺癌患者血清內(nèi)存在差異性的物質(zhì)主要為溶血性磷脂酰膽堿、脂肪酸、甘油及氨基酸等物質(zhì)。溶血磷脂酰膽堿是卵磷脂在磷脂酶A2作用下的水解產(chǎn)物，參與體內(nèi)磷脂代謝，可以引起正常內(nèi)皮的遷移，在傷口的愈合以及血管再生中起到了重要的作用。在一項(xiàng)研究中，研究者在腸內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到0.05 mol/L的溶血性磷脂酸膽堿即可引起一個(gè)典型的細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員的峰和一個(gè)平臺(tái)相[7]。在免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中，溶血性磷脂酰膽堿可以通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的吞噬功能來(lái)上調(diào)粘附分子的表達(dá)，從而在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8]。除此之外，溶血性磷脂酰膽堿還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及炎癥的發(fā)生。生物體內(nèi)正常的磷脂代謝是一個(gè)完整的循環(huán)。溶血磷脂在酶的作用下加減烷基鏈來(lái)完成與磷脂的轉(zhuǎn)化。溶血磷脂酰膽堿烷基轉(zhuǎn)移酶(LPCAT-l)是一類(lèi)調(diào)控磷脂代謝的關(guān)鍵酶，它主要表達(dá)于上皮細(xì)胞中，而小細(xì)胞肺癌是一類(lèi)發(fā)生在支氣管上皮的惡性腫瘤。既往研究表明，溶血磷脂酰膽堿烷基轉(zhuǎn)移酶與肺癌、腸癌等都高度相關(guān)[9-10]。因此，我們可以推斷肺癌的發(fā)生可能導(dǎo)致溶血磷脂酰膽堿烷基轉(zhuǎn)移酶(LPCAT-l)酶活性的部分喪失或功能異常，而溶血磷脂酰膽堿(LPC)作為溶血卵磷脂烷基轉(zhuǎn)移酶(LPCAT-l)的底物則會(huì)出現(xiàn)成分的變化。在本次試驗(yàn)中，對(duì)比小細(xì)胞肺癌患者與健康人群，我們發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出有差異的溶血性磷脂酰膽堿有6種，除了LPC16：0外其他5種均在小細(xì)胞肺癌患者血清內(nèi)高表達(dá)。這一結(jié)果揭示小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)可能存在磷脂失衡的現(xiàn)象，這與其他研究溶血性磷脂酰膽堿可以刺激細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一致的[11-13]。

人體內(nèi)常見(jiàn)的脂肪酸(Fatty acid)包括棕櫚酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸等。在本研究中，亞油酸的氧化產(chǎn)物依泊二醇(9R，10S-EpOME)和十八碳二烯酸(8(R)-HPODE)在小細(xì)胞肺癌患者血清中含量增多，其中依泊二醇在廣泛期小細(xì)胞肺癌患者血清樣本中含量較局限期的更有增高。這一發(fā)現(xiàn)也與之前的研究中惡性腫瘤患者血清中脂肪酸的含量減少相符合[14]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，由于腫瘤細(xì)胞增殖迅速，增殖的過(guò)程中需要大量的能量及原材料滿(mǎn)足自身生長(zhǎng)的需要，這會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)脂肪酸氧化產(chǎn)物增多，脂肪酸含量減少。而由于小細(xì)胞肺癌是一種神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，因此隨著疾病的發(fā)生發(fā)展，其產(chǎn)生的分泌性物質(zhì)也有可能導(dǎo)致脂肪酸的合成受到抑制[15]。亞油酸、油酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，目前相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步表明亞油酸的氧化產(chǎn)物與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[16]，但其具體機(jī)制尚未明確。由此，脂肪酸的合成途徑與腫瘤的相關(guān)性為我們提供了一個(gè)新的研究方向。

同小細(xì)胞肺癌廣泛期相比，小細(xì)胞肺癌局限期患者血清中的游離氨基酸含量顯著升高，其中包括精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。血清中游離氨基酸是蛋白質(zhì)合成的原料，他們通過(guò)一種動(dòng)態(tài)的平衡維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能的需要，他們的含量變化在一定程度上反映了機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和能量代謝的改變。早期小細(xì)胞肺癌患者由于腫瘤細(xì)胞數(shù)量少，能量消耗也相應(yīng)較少，因此血清中游離氨基酸能夠滿(mǎn)足機(jī)體的基本需求。但隨著疾病進(jìn)展，腫瘤發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，腫瘤組織中蛋白質(zhì)合成顯著增加，需要大量攝取多種氨基酸，致使整個(gè)機(jī)體內(nèi)氨基酸代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致游離氨基酸含量顯著減少[17]。同時(shí)，腫瘤患者膳食蛋白攝入減少，營(yíng)養(yǎng)情況惡化，也從另一方面加重了氨基酸代謝的紊亂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示血液中游離氨基酸含量變化可以作為監(jiān)測(cè)小細(xì)胞肺癌疾病進(jìn)展的潛在標(biāo)志物的同時(shí)，也提示了小細(xì)胞肺癌患者除了進(jìn)行放療、化療等傳統(tǒng)治療外，也應(yīng)注重營(yíng)養(yǎng)支持治療。

綜上所述，本研究通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)證明了小細(xì)胞肺癌患者在磷脂代謝、脂肪酸代謝和蛋白質(zhì)代謝等方面均可表現(xiàn)為不同程度的紊亂，證明通過(guò)檢測(cè)血清差異性代謝產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)尋找潛在疾病是一種具有前景的手段，此技術(shù)有助于從小分子代謝水平理解小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。腫瘤的發(fā)生離不開(kāi)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化，內(nèi)環(huán)境小分子物質(zhì)變化又是腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如何能夠改變腫瘤生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境物質(zhì)，阻斷腫瘤能量供應(yīng)途徑從而達(dá)到抗腫瘤的目的，是我們下一步需要探討的問(wèn)題。代謝組學(xué)技術(shù)，具有無(wú)創(chuàng)性、能夠高通量檢測(cè)實(shí)時(shí)代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的特點(diǎn)，有望為小細(xì)胞肺癌診斷、評(píng)價(jià)療效、判斷預(yù)后開(kāi)辟新的方法。