秦 文 趙楠楠 韓永煥 徐亞君

胃癌(Gastric cancer，GC)是世界范圍最常見的惡性腫瘤[1]。在我國，GC在惡性腫瘤中的發(fā)病率高居第二位，是癌癥死亡的第二主要原因[2-3]。近年來盡管飲食習慣的改善和醫(yī)療保健的提升，胃癌發(fā)病率有所下降，但晚期GC的預(yù)后仍很差。因此，迫切需要尋找早期診斷和治療GC的靶點。最新研究顯示，鋅指蛋白(ZFPs)家族作為癌基因或抑癌基因，廣泛參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]；ZNF436是最近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，在多種實體瘤中發(fā)揮著重要的作用，但在胃癌中的作用機制尚不清楚[7-8]。本研究通過驗證ZNF436基因在人胃癌組織和細胞系中表達，分析對胃癌生存期影響，及ZNF436對人胃癌細胞遷移和侵襲作用，以期揭示其對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2015年1月—2018年1月赤峰學院附屬醫(yī)院治療的45例胃癌患者，24例正常胃組織的臨床資料；胃癌患者年齡39～74歲，中位年齡55.4歲；其中男性29例，女性16例；兩組年齡和性別無統(tǒng)計學差異。胃癌組織選取包括手術(shù)中取得的癌組織和癌旁組織，正常胃組織來源于體檢篩查患者組織；所有組織均在液氮中快速冷凍，然后貯存于-80℃。所有腫瘤患者均為原發(fā)性胃癌，在手術(shù)切除前均未接受化療、放療或其他治療，無其他合并腫瘤；排除標準：臨床資料不全者、合并嚴重糖尿病心臟病的疾病、轉(zhuǎn)移性腫瘤、既往胃腸道手術(shù)治療史。該研究由赤峰學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽字同意。根據(jù)美國聯(lián)合發(fā)布的TNM分期指南(2016)癌癥委員會，病理診斷由本院兩位病理學家出具。ZNF436表達與預(yù)后通過在線生存數(shù)據(jù)分析(http：//kmplot.com/analysis/)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 本研究中胃癌細胞系及其永生化人胃粘膜上皮細胞系在添加10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)液中加入1%青霉素/鏈霉素；在37℃，5%CO2的細胞孵育箱中培養(yǎng)；當培養(yǎng)液微黃或變黃時重新消化離心并更換細胞培養(yǎng)液。

1.2.2 ZNF436敲減載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染 ZNF436-siRNA設(shè)定為本研究的實驗組、NC-siRNA設(shè)定為本研究的對照組；收集活性狀態(tài)下的胃癌MKN028細胞，消化、離心后種于六孔板中；在細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞密度至70%～80%時進行細胞轉(zhuǎn)染，以Lipofectamine-3000為轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染Si-Flag-ZNF436質(zhì)粒(實驗組)和空質(zhì)粒Si-Flag-NC(對照組)，每孔5 μg質(zhì)粒，細胞在孵育箱中培養(yǎng)48 h后，收集細胞進行相應(yīng)的功能實驗。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR 從細胞系和新鮮標本中提取總RNA。參考說明書要求，使用TransZol RNA試劑盒提取。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，通過qRT-PCR驗證基因的相對表達。反應(yīng)條件為：95℃變性10 min，95℃持續(xù)15 s，60℃持續(xù)20 s，72℃持續(xù)20 s，最后72℃延伸30 s；共40個總循環(huán)；以β-actin為內(nèi)參引物。實時熒光的相對表達分析PCR擴增程度，以擴增指數(shù)期為起始模板進行半定量分析；擴增指數(shù)越高，mRNA的相對表達越高。所有實驗獨立重復(fù)三次。

1.2.4 細胞劃痕實驗 收集上述實驗組和對照組胃癌細胞株MKN028；消化，離心，計數(shù)，取1×105細胞均勻種植于無菌六孔板中；細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，約20 h細胞融合度約90%時，以無菌小槍頭在六孔板底部輕微垂直劃線，以無血清1640液繼續(xù)培養(yǎng)，間隔12 h倒置顯微鏡下拍照，測量不同時間段的劃痕寬度以評估細胞遷移能力。

1.2.5 Transwell細胞侵襲實驗 在Transwell小室上室中加入基質(zhì)膠(無血清1640∶基質(zhì)膠=1∶5)混勻，基質(zhì)膠小室放入細胞孵育箱中約2～4 h，待基質(zhì)膠凝固。收集實驗組和對照組細胞，消化，離心，計數(shù)，取3×103細胞/空種于小室上室；下室加入15% 1640培養(yǎng)基后放入細胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，固定，染色，計數(shù)；計數(shù)并評價細胞遷移能力。

1.2.6 免疫蛋白印跡實驗 從組織或細胞中提取蛋白質(zhì)并使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒定量蛋白濃度；處理后蛋白樣品上樣，每孔約50 μg；通過十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；分別加入一抗孵育4℃過夜；室溫下加入二抗封閉孵育1～2 h；顯色劑顯色，對蛋白條帶進行吸光度掃描。目的和對照基因蛋白相對表達以吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值表示；所有實驗獨立重復(fù)三次。

1.2.7 裸鼠成瘤實驗檢測ZNF436基因敲除對腫瘤細胞增殖的影響 裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的方法和步驟同文獻所述[6]。收集穩(wěn)定敲降ZNF436的MKN028細胞和對照細胞(3×106/孔)，離心后使用2 mL PBS重懸，將PBS的腫瘤細胞液5 s內(nèi)注入裸鼠尾靜脈(n=5)；繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠約8周后處死，予以取出肝臟中轉(zhuǎn)移瘤，并進行相應(yīng)的功能實驗。

1.2.8 免疫組織化療法 組織切片脫蠟、脫缸、抗原修復(fù)(微波熱修復(fù)法)、H2O2室溫下封閉、孵一抗和二抗、DAB顯色、染核、封片鏡檢等。在倒置顯微鏡下隨機五個視野，計算相對光密度。選用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。根據(jù)病理評分標準[11]：兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，按染色深淺進行評分，無陽性染色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細胞非百分比評分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后二者相乘，0～4分為低表達，4～12分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各實驗均獨立重復(fù)3次，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。癌與癌旁組織配對分析采用配對t檢驗，生存分析采用在線Kaplan-Meier生存曲線分析ZNF436的表達與預(yù)后關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF436 mRNA在胃癌組織和細胞系中表達

與癌旁組織相比，ZNF436 mRNA表達在胃癌組織中表達上調(diào)(P<0.001)(圖1A)；與正常胃組織相比，ZNF436 mRNA表達在胃癌組織中表達上調(diào)(圖1B)(P<0.001)。同時對ZNF436 mRNA在胃癌細胞系中相對表達的研究發(fā)現(xiàn)，與永分化胃上皮細胞GES-1相比，ZNF436 mRNA在胃癌細胞系MKN028、AGS、SGC-7901、BGC-823和MGC-803中表達上調(diào)(圖1C)(P<0.001)。在線生存數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ZNF436的表達程度與胃癌預(yù)后有關(guān)，ZNF436基因高表達患者預(yù)后比低表達患者差(P=0.0038)(圖1D)；提示ZNF436可能作為潛在癌基因參與胃癌的進展。

圖1 ZNF436在胃癌組織和細胞系中表達Figure 1 Expression of ZNF436 in gastric cancer cell lines and gastric cancer tissuesNote：A.The expression of ZNF436 mRNA was up-regulated in gastric cancer tissues，P<0.001；B.The expression of ZNF436 mRNA was up-regulated in gastric cancer tissues，P<0.001；C.The expression of ZNF436 mRNA was up-regulated in gastric cancer cells when compared to GES-1 cells，*** P<0.001；D.Prognostic analyses showed that the high level of ZNF436 could herald a worse survival rate.

2.2 ZNF436蛋白在胃癌組織中表達

與配對癌旁組織相比，ZNF436蛋白在胃癌組織中高表達(t=12.45，P<0.001)。通過IPP8.0軟件分析ZNF436蛋白表達光密度顯示，與配對癌旁正常組織相比，ZNF436在胃癌中光密度升高(t=16.23，P<0.001)(圖2)。因此，研究顯示ZNF436可能作為癌基因參與胃癌的進程。

2.3 ZNF436基因敲降抑制細胞遷移和侵襲

為進一步驗證ZNF436基因能否作為功能性癌基因參與胃癌的進程。本研究選取了ZNF436表達最高的胃癌細胞系MKN028為研究對象。進一步對胃癌細胞系MKN028中ZNF436基因進行敲降；細胞劃痕實驗顯示，穩(wěn)定敲降ZNF436的實驗組MKN028細胞劃痕愈合能力顯著低于對照組(P<0.001)(圖3A)。Transwell實驗對細胞侵襲能力做了定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降ZNF436的實驗組穿過小室的細胞數(shù)顯著低于對照組(P<0.001)(圖3B)。

圖2 免疫組織化學法檢測ZNF436蛋白在人胃癌組織中的表達Figure 2 Expression of ZNF436 protein in human gastric cancer tissuesNote：A.Immunohistochemistry；B.Expression of ZNF436 protein was up-regulated in gastric cancer tissues when compared with adjacent tissues，P<0.001.

圖3 ZNF436對細胞遷移和侵襲的影響Figure 3 Effects of ZNF436 on migration and invasion of ZNF436 cellsNote：A.Migration of empty vector- or si-ZNF436 tumor cells in scratch wound healing assays，P<0.001(200×)；B.The invasion capacity of vector- or si-ZNF436 cells was decreased，*** P<0.001(200 ×).

2.4 ZNF436基因敲降在體內(nèi)抑制腫瘤細胞增殖

前期體外實驗中敲降ZNF436基因后能抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，為進一步探討敲降ZNF436基因是否可以抑制裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的生長；本研究將實驗組細胞和對照組細胞注入裸鼠尾靜脈，在注射后8周從取出裸鼠肝臟；結(jié)果顯示，實驗組小鼠的腫瘤大小和平均體積顯著降低(P<0.001)(圖4A)。HE染色研究腫瘤的表達(圖4B)，免疫蛋白印跡實驗分析ZNF436和Ki-67的表達；與對照組相比，細胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67的表達顯著減少(P<0.001)(圖4C，4D)。

2.5 ZNF436基因敲降抑制胃癌細胞遷移和侵襲的機制

分別取實驗組和對照組中細胞，提取mRNA總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測WNT/β-catenin以及下游靶基因、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子的表達水平。結(jié)果顯示，ZNF436基因敲降后active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin、MMP7的蛋白和mRNA表達下調(diào)(P<0.001)；E-cadherin的蛋白表達水平上調(diào)(P<0.001)(圖5A，5B)。

圖4 Si-ZNF436在體內(nèi)實驗中抑制轉(zhuǎn)移瘤的形成Figure 4 siRNA ZNF436 inhibited tumor transformation in vivoNote：A.tumors derived from nude mice；B.HE staining；C.Relative expression of ZNF436 and Ki67 in nude mice tumor tissues；D.Quantitative analysis of protein，***P<0.001，when compared with the vector.

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測ZNF436敲降后對WNT/β-catenin信號通路的影響Figure 5 Ectopic expression of ZNF436 disrupted the WNT/β-catenin signalingNote：A.Western blot was performed using antibodies against total β-catenin，active β-catenin and its downstream targets；B.Quantitative analysis of protein，*** P<0.001，when compared with the vector.

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床最常見的消化道惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中發(fā)病率位居前列；胃癌的發(fā)病呈年輕化的傾向[9]。由于地域經(jīng)濟、醫(yī)療水平的差異；大多數(shù)胃癌患者缺乏有效的早期篩查手段；部分確診患者發(fā)現(xiàn)時即為局部晚期或合并遠處轉(zhuǎn)移；而轉(zhuǎn)移是胃癌治療失敗的主要原因之一。轉(zhuǎn)移仍然是腫瘤治療最大的臨床挑戰(zhàn)，也是導(dǎo)致癌癥死亡和腫瘤綜合治療失敗的重要原因。因此，如何預(yù)防與治療轉(zhuǎn)移是提高和改善臨床預(yù)后的重要基礎(chǔ)。隨著基因組學的深入研究，越來越多的學者開始致力于腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的相關(guān)靶點的研究，以期尋找腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的分子靶點。EMT是一種保守的細胞過程，其特點是上皮細胞極性喪失，間質(zhì)細胞發(fā)育特征明顯，可侵襲和遷移至全身，被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制[10]。在胃癌的各種研究中已經(jīng)證實了EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)移。EMT可以通過檢測上皮標記物，如E-鈣粘蛋白和間充質(zhì)標記物，如波形蛋白和N-鈣粘蛋白。鑒于腫瘤轉(zhuǎn)移屬性，癌癥發(fā)病的EMT過程已被認為是癌變的關(guān)鍵標志，因此，尋找和證實EMT過程中的相關(guān)靶點具有重要臨床意義。

鋅指蛋白(ZFPs)是脊椎動物基因組家族中最大的轉(zhuǎn)錄因子；大約1/3的ZFP包含與Krüppel相關(guān)KRAB結(jié)構(gòu)，超過一半ZFPS聚集在染色體19q13區(qū)域[6-8]。ZFPs在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、分化和腫瘤發(fā)生中起重要作用。部分ZFPs基因如ZBRK1、ZNF382和ZNF569被報道作為抑癌基因參與腫瘤進展[11]；啟動子甲基化對腫瘤抑癌基因的異常失活常常與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。而ZFPs在胃癌中作用的報道非常少見。ZNF436的cDNA為3.8 kb，編碼470個氨基酸[6-8]；這種蛋白質(zhì)在從大鼠到人的不同脊椎動物物種的進化過程中高度保守；已有文獻報道在組織器官發(fā)育，腫瘤形成中具有重要的作用，但在胃癌中的作用尚不清楚。

本研究中ZNF436在胃癌細胞系和組織中均表達上調(diào)。在線數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大樣本臨床預(yù)后數(shù)據(jù)研究中，ZNF436的高表達提示預(yù)后不良，提示ZNF436可能作為功能性癌基因參與胃癌的進程中[6-8]。通過基因敲降使ZNF436高表達的胃癌細胞系MKN028中ZNF436表達下調(diào)；細胞劃痕實驗顯示，敲降ZNF436基因后實驗組劃痕愈合能力顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。侵襲實驗顯示，敲降ZNF436基因后的實驗組細胞，細胞侵襲能力明顯下調(diào)。文獻研究顯示，ZFPs通過WNT/β-catenin信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ZNF436是否也通過WNT/β-catenin信號通路調(diào)控胃癌的轉(zhuǎn)移尚不清楚。進一步驗證ZNF436調(diào)控胃癌細胞系MKN028遷移和侵襲的分子機制發(fā)現(xiàn)，敲降ZNF436后的實驗組細胞中，active β-catenin、c-myc、Vimentin、N-cadherin和MMP7的蛋白表達水平降低，E-cadherin的蛋白表達水平上調(diào)；與文中報道相一致[12]。而β-catenin蛋白的異常活化是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因[16]；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)使腫瘤細胞獲得了遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，與腫瘤遷移和侵襲密切相關(guān)，往往提示著預(yù)后不良[13]；MMPs的活化是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程[19]。

綜述所述，ZNF436在胃癌中表達上調(diào)，可能作為潛在的癌基因參與胃癌的轉(zhuǎn)移中；但ZNF436基因能否作為胃癌診斷、治療和判斷預(yù)后的分子靶點，尚需要進一步臨床驗證。