孟 海 杜觀祥 朱利玲 湯琪云

胃癌是我國最常見的惡性消化道腫瘤之一，其發(fā)病率位于男性惡性腫瘤第二位，女性胃癌發(fā)病率低于乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌，位居第4位。不同細(xì)胞周期蛋白異?？梢砸鹉[瘤細(xì)胞失控性復(fù)制，這是腫瘤的重要特征之一，也是針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行周期性治療的理論基礎(chǔ)[1-2]。WEE1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，最早在粟酒裂殖酵母中被發(fā)現(xiàn)，缺少WEE1的酵母細(xì)胞可以在體積達(dá)到正常大小的一半時(shí)進(jìn)行分裂，導(dǎo)致體積較小，研究者以此為線索，發(fā)現(xiàn)了WEE1負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素依賴性激酶活性的功能。在腫瘤細(xì)胞中，WEE1可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換、組蛋白合成及DNA損傷的修復(fù)，維持基因組穩(wěn)定[3-4]。在結(jié)腸癌[5]、黑色素瘤[6]、乳腺癌[7]等多種實(shí)體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)存在WEE1的過表達(dá)，但在胃癌中相關(guān)報(bào)道極少。因此，本研究收集了78例胃癌患者為研究對(duì)象，探討WEE1在胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響，以期為胃癌的機(jī)制學(xué)研究提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2011年1月—2013年9月我院收治的胃癌患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次確診胃癌；(2)術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；(3)無胃部手術(shù)史及其他病史；(4)臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)圍術(shù)期死亡病例；(2)合并有其他器官的惡性腫瘤；(3)因腫瘤相關(guān)腸梗阻等行急診手術(shù)。最終，78例患者被納入研究。其中，男性46例，女性32例。年齡32～83歲，中位年齡56歲。以術(shù)后病理學(xué)報(bào)告為參照，根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，將患者分為淋巴結(jié)(-)組與淋巴結(jié)(+)組，分別有26例和52例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 免疫組化檢測(cè)

兔抗人WEE1單克隆抗體及SP試劑盒購于美國Zymed公司。DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。胃癌組織經(jīng)甲醛固定后，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟、水化，滴加兔抗人WEE1單克隆抗體，低溫孵育，加入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，設(shè)置對(duì)照組。采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果，以出現(xiàn)棕色顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度，無染色：0分，淺黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分；高倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞陽性率，陽性率：陽性率<25%：1分，陽性率介于25%～50%：2分，陽性率介于50%～75%：3分，陽性率>75%：4分。兩者乘積結(jié)果0分為陰性，1～8分為低表達(dá)，9～12分為高表達(dá)。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)

TRIzol購于美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司。采用TRlzol法提取胃癌組織中的RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，利用SYBGGreen試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物序列為Sence：5′-CCACCACCCTGCCAGTTAAC-3′，Antisence：5′-TAAACTTTTGTGCAACCAGGGTAA-3′，反應(yīng)條件為，50℃ 2 min，95℃變性15 s、30℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平采用2-△△Ct法確定。

1.4 隨訪

隨訪采用門診、電話等形式進(jìn)行。以患者死亡作為隨訪終點(diǎn)。隨訪間隔為術(shù)后第1年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后1年以上每半年隨訪1次，直至隨訪終點(diǎn)或失訪，隨訪截止時(shí)間為2018年8月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和率表示，單因素分析采用卡方檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析。采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組患者生存曲線差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

WEE1在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)均有明顯表達(dá)，表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒，總陽性率為43.6%，低表達(dá)13例，高表達(dá)21例。其中，淋巴結(jié)(+)組與淋巴結(jié)(-)組的WEE1的陽性率分別為53.8%(28/52)、23.1%(6/26)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.674，P=0.010)(圖1)。

2.2 兩組患者的WEE1 mRNA表達(dá)量比較

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，淋巴結(jié)(-)與淋巴結(jié)(+)患者的平均WEE1 mRNA表達(dá)量分別為(1.32±0.21)和(3.64±0.41)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

2.3 WEE1 mRNA表達(dá)量對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)效能的ROC曲線

ROC曲線結(jié)果顯示，WEE1 mRNA表達(dá)水平對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的曲線下面積為0.806，敏感性84.8%，特異性79.6%，P<0.01，有較好的診斷效能(圖3)。

圖1 免疫組化染色結(jié)果Figure 1 The expression of WEE1 in gastric cancer tissues by immunohistochemistryNote：A.The negative expression of WEE1 in gastric cancer tissues(100 ×)；B.The positive expression of WEE1 in gastric cancer tissues(100 ×)；C.The positive expression of WEE1 in gastric cancer tissues(400 ×).

2.4 WEE1表達(dá)與胃癌病理參數(shù)的關(guān)系

WEE1表達(dá)與胃癌癌灶大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤有關(guān)(P<0.05)，但與腫瘤部位、腫瘤大小、Lauren分型、M分期無關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 WEE1表達(dá)與胃癌病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 The effect of WEE1 expression on parameters of gastric cancer by univariate analysis

2.5 胃癌病理參數(shù)對(duì)WEE1表達(dá)影響的多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，T分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響WEE1表達(dá)的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表2)。

表2 胃癌病理參數(shù)對(duì)WEE1表達(dá)影響的多因素分析Table 2 The effect of parameters of gastric cancer on WEE1 expression by multivariate analysis

圖2 兩組患者的WEE1 mRNA表達(dá)量比較Figure 2 The mRNA expression of WEE1 in LN(+)and LN(-)groups

圖3 WEE1 mRNA表達(dá)量對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)效能的ROC曲線Figure 3 ROC curve of WEE1 expression in predicting lymph node metastasis of gastric caner

2.5 WEE1表達(dá)對(duì)患者5年生存率及總體生存期的影響

78例患者，失訪率為8.9%。5年內(nèi)死亡41例，其中，WEE1(-)組、WEE1低表達(dá)組、WEE1高表達(dá)組分別死亡13例、10例、18例，三組患者的5年生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=25.67，P<0.001)。兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，WEE1低表達(dá)組與WEE1高表達(dá)的生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但均顯著低于WEE1(-)組(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同WEE1表達(dá)強(qiáng)度患者的生存曲線Figure 4 Survival curve of patients with different levels of WEE1

3 討論

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活習(xí)慣、食物譜都發(fā)生了巨大改變，胃癌的發(fā)病率也呈明顯的上升趨勢(shì)，找尋更具治療意義的分子靶點(diǎn)有重要意義[8-9]。正常細(xì)胞在G1期修復(fù)損傷DNA，但腫瘤細(xì)胞常伴有G1～S期檢查點(diǎn)缺陷[10]，通常依賴G2～M期檢查點(diǎn)完成DNA修復(fù)，這為靶向WEE1激酶抑制劑治療惡性腫瘤提供了理論基礎(chǔ)[11-12]。一項(xiàng)Ⅱ期臨床研究也證實(shí)[13]，WEE1抑制劑AZD1775對(duì)一線治療抵抗或耐藥的TP53突變型卵巢癌患者有效，但在胃癌中，WEE1的相關(guān)研究尚處于起步階段。

在本研究中，我們從蛋白及分子兩個(gè)層面對(duì)WEE1表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。免疫組化結(jié)果表明，WEE1在胃癌組織中的總體陽性率為43.6%，其中，淋巴結(jié)(+)組與淋巴結(jié)(-)組的WEE1的陽性率分別為53.8%、23.1%。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)(+)組的胃癌組織中WEE1 mRNA平均表達(dá)量顯著高于淋巴結(jié)(-)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其胃癌組織內(nèi)WEE1表達(dá)水平也明顯更高，可能由于WEE1陽性表達(dá)的胃癌細(xì)胞分化增殖能力更強(qiáng)，侵入淋巴管或血管的風(fēng)險(xiǎn)更高。在此基礎(chǔ)上，我們分析了WEE1表達(dá)對(duì)胃癌臨床病理參數(shù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WEE1表達(dá)對(duì)胃癌癌灶大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤有明顯影響，進(jìn)一步行多因素分析發(fā)現(xiàn)，T分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響WEE1表達(dá)的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。提示W(wǎng)EE1的表達(dá)可能參與了胃癌腫瘤細(xì)胞的浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。隨訪后發(fā)現(xiàn)，WEE1低表達(dá)組與WEE1高表達(dá)組的生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均顯著低于WEE1(-)組。WEE1的陽性表達(dá)意味著更高的T分期與N分期，同時(shí)也可能導(dǎo)致脈管浸潤的發(fā)生率提高。這些不良因素共同作用，使得WEE1(+)患者預(yù)后明顯較差。相應(yīng)地，WEE1(-)患者預(yù)后較好。

綜上所述，WEE1在胃癌中有較高的陽性率，且與患者分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其陽性表達(dá)是患者預(yù)后不良的強(qiáng)烈信號(hào)。但本研究為單中心研究，樣本量較小，未來在多中心聯(lián)合的基礎(chǔ)上，實(shí)施更大樣本量的研究，或能得出更具說服力的結(jié)論。