王曉雅 肖 斌 廖 揚(yáng) 唐榮芝 孫朝暉 李林海

乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，發(fā)病率位居所有女性腫瘤第一位[1]。根據(jù)細(xì)胞表面受體的表達(dá)特征，乳腺癌可分為4種亞型：Luminal A、Luminal B、HER2陽性及三陰型(Triple negative breast cancer，TNBC)[2]，其中TNBC的治療難度最高，并且預(yù)后最不理想[3-4]。趨化因子是一類能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白[5]，通常由70～100個(gè)氨基酸組成，可分成四種類型：CXC類、CC類、C類和CX3C類。趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的GTP蛋白耦聯(lián)的跨膜受體，CXCR家族蛋白是趨化因子受體的重要的亞家族。研究表明，CXCR家族蛋白既可以通過活化免疫細(xì)胞或抑制血管增殖發(fā)揮抗腫瘤的作用，又能夠趨化腫瘤細(xì)胞和血管增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，最終促進(jìn)腫瘤生長浸潤、趨化轉(zhuǎn)移[6]。因此CXCR家族蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的雙向調(diào)節(jié)作用。

CXCR家族包括CXCR1-7共七種蛋白及其異構(gòu)體[7]，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的小鼠模型以及臨床組織樣本的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR2缺陷型小鼠異位灶自發(fā)轉(zhuǎn)移明顯減少，原發(fā)腫瘤壞死明顯比CXCR2非缺陷型小鼠增多，CXCR4mRNA在癌組織中高表達(dá)而正常組織中沒有表達(dá)[8-11]。Choi等[9]通過檢測(cè)晚期結(jié)直腸癌患者血清標(biāo)本發(fā)現(xiàn)具有更多轉(zhuǎn)移灶患者的血清CXCR4水平明顯高于非轉(zhuǎn)移患者。CXCR4還通過RUNX2-CXCR4軸促進(jìn)人胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。對(duì)前列腺癌以及前膀胱癌臨床樣本的分析也得到相似的結(jié)論，CXCR6和CXCR7在這兩種腫瘤細(xì)胞中均有高水平的表達(dá)[12-13]。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，CXCR家族蛋白在肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌等腫瘤中的高表達(dá)是明確的但是作用機(jī)制尚未有詳細(xì)的報(bào)道，其在乳腺癌中的診斷和聯(lián)合靶向治療價(jià)值也尚不明確。本文擬研究CXCR家族蛋白在乳腺癌各亞型及癌旁組織中的表達(dá)水平，闡明差異表達(dá)蛋白與患者預(yù)后的相關(guān)性，為乳腺癌的早期分子診斷以及聯(lián)合靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

登陸TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//cancergenome.nih.gov/)下載CXCR家族蛋白在四個(gè)亞型(HER2、Luminal A、Luminal B和TNBC)乳腺癌組織以及癌旁織中的表達(dá)共計(jì)797例相關(guān)數(shù)據(jù)，并根據(jù)分子分型將乳腺癌樣本分為四類，其中HER2 37例，Luminal A 443例，Luminal B 126例，TNBC 115例，癌旁組織76例。

1.2 預(yù)后分析

從PRECOG網(wǎng)站(https：//precog.standford.edu/)中獲取CXCR家族蛋白各成員的表達(dá)水平與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的生存曲線(圖2)，結(jié)合數(shù)據(jù)對(duì)各個(gè)蛋白進(jìn)行預(yù)后分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CXCR家族蛋白在各亞型乳腺癌組織以及癌旁組織中表達(dá)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

CXCR2P1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7在乳腺癌組織以及癌旁組織中表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中CXCR2P1、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6在乳腺癌組織中高表達(dá)，CXCR2、CXCR7在乳腺癌組織中低表達(dá)；CXCR1在乳腺癌組織以及癌旁組織中表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 CXCR蛋白在各亞型乳腺癌以及正常組織表達(dá)水平Table 1 The expressive levels of CXCR proteins in various subtypes of breast cancer tissues and adjacent tissues

Note：Breast cancer patients were divided into 4 subtypes：HER2，Luminal A，Luminal B and TNBC.Normal referred adjacent tissues of breast cancer.Brest cancer referred all 4 subtypes of breast cancer samples.

2.2 CXCR家族蛋白在乳腺癌組織以及癌旁組織中表達(dá)水平

CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR2P1和CXCR7在HER2、LuminalA、LuminalB、TNBC和癌旁組織中表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1)。其中CXCR2在HER2和Luminal A、Luminal A和Luminal B、Luminal A和TNBC亞型之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；CXCR3在HER2和Luminal B、Luminal B和TNBC亞型之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；CXCR4、CXCR5、CXCR6和CXCR7分別在HER2和Luminal A、 Luminal B和TNBC、 HER2和TNBC、Luminal A和Luminal B中無表達(dá)差異(P>0.05)，而在其他各亞型間的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；除HER2和TNBC比較以外，CXCR7在各亞型之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；除HER2和Luminal A、HER2和Luminal B比較以外，CXCR2P1在各亞型之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 CXCR家族蛋白在乳腺癌各亞型及癌旁組織中表達(dá)水平Figure 1 The figures showed the expression of CXCR family proteins in different subtypes of breast cancer tissues and adjacent tissuesNote：A.The expression of CXCR2P1 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=349.8，P<0.001)；B.The expression of CXCR2 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=2.902，P<0.001)；C.The expression of CXCR3 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=54.89，P<0.001)；D.The expression of CXCR4 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=16.09，P<0.001)；E.The expression of CXCR5 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=252.7，P=0.011)；F.The expression of CXCR6 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=6.515，P=0.015)；and G.The expression of CXCR7 in different subtypes of breast cancer and adjacent tissues(F=6.478，P<0.001).* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，when compared to the corresponding group.

2.3 差異表達(dá)CXCR家族蛋白與患者無病生存期(DFS)的關(guān)系

CXCR3高表達(dá)患者DFS差于低表達(dá)患者(P<0.0001)(圖2A)，CXCR4、CXCR7、CXCR6高表達(dá)患者DFS優(yōu)于低表達(dá)患者(圖2B、2C、2D)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 差異表達(dá)CXCR蛋白與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Figure 2 The relationship between the differential expression of CXCR family and prognosis of breast cancerNote：Figures A-D were derived from Miller LD[14]，etc.

3 討論

本研究通過對(duì)TCGA中的乳腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在CXCR家族蛋白中CXCR3、CXCR4、CXCR6、CXCR7在乳腺癌組織和正常組織中表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示這些蛋白可能是乳腺癌的診斷或治療靶點(diǎn)。

CXCR家族蛋白在惡性腫瘤中的生物學(xué)作用具有復(fù)雜性和多樣性。CXCR3是趨化因子CXCL9的受體，屬于視紫紅質(zhì)樣七跨膜GPCR和CXCR亞家族的超家族，CXCR3有三種異構(gòu)體，分別是CXCR3-A、CXCR3-B和CXCR3-alt[15]。Li等[16]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中CXCR3的水平明顯高于正常組織，CXCR3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、腫瘤大小、pTNM腫瘤分期呈正相關(guān)。其作用機(jī)制可能是CXCR3配體通過調(diào)控組織蛋白酶B(CTSB)從而促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。本文的研究結(jié)果顯示CXCR3在乳腺癌的HER2、Luminal A、Luminal B和TNBC各亞型中的表達(dá)水平均高于癌旁組織，生存預(yù)后曲線也提示CXCR3高表達(dá)的患者預(yù)后較差，以上數(shù)據(jù)都支持CXCR3可作為乳腺癌的潛在的診斷或治療靶點(diǎn)。

CXCR4在高度轉(zhuǎn)移性乳腺癌的發(fā)展中起著重要作用，使用CXCR4拮抗劑能夠選擇性地促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)對(duì)其它淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性[18]。而在斑馬魚異種移植模型，CXCR4抑制劑也成功阻斷了TNBC早期轉(zhuǎn)移的發(fā)生[19]。本研究中CXCR4在乳腺癌組織的表達(dá)量遠(yuǎn)高于癌旁組織，與文獻(xiàn)中提到的CXCR4的促癌作用相符，充分說明CXCR4可能作為TNBC轉(zhuǎn)移的靶向治療靶點(diǎn)。有研究表明CXCR6/ERK1/2/RhoA/cofilin/F-actin通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中十分重要[20]，另一項(xiàng)研究也表明CXCR6在乳腺癌高侵襲性細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于低侵襲性細(xì)胞系[21]，說明CXCR6的表達(dá)與乳腺癌的侵襲力密切相關(guān)。本文研究結(jié)果也提示CXCR6在四個(gè)亞型乳腺癌中的表達(dá)全部都高于癌旁組織，CXCR6也有望成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CXCR4、CXCR6的預(yù)后圖與數(shù)據(jù)以及文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果并不完全符合，可能是由于CXCR蛋白的生理作用取決于具體的細(xì)胞類型，在不同的細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用導(dǎo)致，CXCR蛋白自身不同的亞型和異構(gòu)體也可能產(chǎn)生不同的生理作用，例如CXCR3-A和CXCR3-B產(chǎn)生完全相反的生理功能[15]。另外由于本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是從TCGA數(shù)據(jù)庫直接獲取，但是TCGA的樣本數(shù)據(jù)不包含患者的基本情況以及預(yù)后，只能描繪靜態(tài)的突變或者變異，并且不能反映基因水平到蛋白水平的改變，無法得知研究對(duì)象處于乳腺癌的哪一病理階段，這是TCGA數(shù)據(jù)庫的一個(gè)不足之處，而CXCR蛋白在乳腺癌不同的病理階段是否有不同的表達(dá)特征也不清楚，因此這一推測(cè)還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

TCGA數(shù)據(jù)庫收錄了各種人類癌癥的臨床數(shù)據(jù)、基因變異、mRNA表達(dá)、miRNA表達(dá)、甲基化等數(shù)據(jù)，是腫瘤研究者重要的數(shù)據(jù)來源。其數(shù)據(jù)分為三個(gè)等級(jí)，其中1、2等級(jí)的數(shù)據(jù)通常是限制下載，需要權(quán)限才可獲取，等級(jí)3的數(shù)據(jù)大部分是開放下載的。TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)癌癥生物學(xué)、基因組學(xué)技術(shù)、生物儲(chǔ)藏庫和生物信息學(xué)領(lǐng)域的最新成果的應(yīng)用都具有很大的幫助，科學(xué)合理地應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫將給我們的科研工作帶來事半功倍的效果。本課題組在后續(xù)的研究中將繼續(xù)采用多種實(shí)驗(yàn)方法繼續(xù)驗(yàn)證CXCR家族蛋白在乳腺癌各亞型中的差異表達(dá)情況。

綜上所述，CXCR蛋白可能是乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)，以單個(gè)或者聯(lián)合多個(gè)CXCR蛋白進(jìn)行靶向治療可能給轉(zhuǎn)移性或難治性乳腺癌帶來肯定的治療效果有助于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。