孫立春 李丹丹 李 凈 于鳳玲

肺癌對(duì)人群健康和生命具有重大的威脅。盡管有手術(shù)、化療、放療、靶向等治療手段，但肺癌患者的生存時(shí)間仍較短[1-2]。需要尋找新的與診斷治療預(yù)后相關(guān)的靶點(diǎn)，為最終攻克肺癌奠定基礎(chǔ)。

卷曲螺旋結(jié)構(gòu)蛋白8(Coiled-coil domain containing 8，CCDC8)基因參與細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)調(diào)控，與3M綜合征(3M Syndrome)密切相關(guān)[3]。CCDC8與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系尚不明確。本研究在TCGA數(shù)據(jù)庫的非小細(xì)胞肺癌數(shù)據(jù)中分析發(fā)現(xiàn)CCDC8表達(dá)與TGF-β1表達(dá)相關(guān)，因此我們推測(cè)CCDC8可能與TGF-β1途徑相互作用，在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。我們?cè)赥CGA非小細(xì)胞肺癌數(shù)據(jù)庫分析了CCDC8和TGF-β1表達(dá)與患者生存的關(guān)系。并在我院204例非小細(xì)胞肺癌病理組織中分析了CCDC8和TGF-β1的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)及患者生存的關(guān)系，為進(jìn)一步研究CCDC8和TGF-β1在非小細(xì)胞肺癌中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用TCGA公開的NSCLC數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析CCDC8、TGF-β1 RNAseq與患者生存關(guān)系。病理標(biāo)本取自我院2013年1月—2014年1月經(jīng)過治療的手術(shù)病理證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌組織。全組病人中腺癌122例，鱗癌82例；男性136例，女性68例，平均年齡57.56±9.03歲(31～76歲)。組織學(xué)分級(jí)：高分化12例，中分化96例，低分化96例。TNM分期：Ⅰ期91例，Ⅱ期42例，Ⅲ期71例。所有組織取下快速處理后于-80℃冰箱中保存，隨訪工作通過與病人或家屬的溝通進(jìn)行。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

抗體CCDC8、TGF-β1的稀釋度分別為1∶50，1∶80，置于4℃冰箱過夜，DAB顯色。用已知NSCLC陽性切片作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以癌細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核染色呈棕黃色顆粒為陽性。由兩位病理醫(yī)生單獨(dú)判定結(jié)果。結(jié)果判定：根據(jù)陽性細(xì)胞染色的百分率分級(jí)：0：0%～5%；1：6%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：>75%。根據(jù)染色強(qiáng)度分級(jí)：1：淡黃色染色沒有明顯顆粒；2：黃色染色有明顯顆粒；3：棕黃色染色明顯顆粒。兩個(gè)評(píng)分相乘得到最后評(píng)分：0～4為陰性；6～12為CCDC8、TGF-β1陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用R軟件對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)免疫組化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CCDC8、TGF-β1與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析；生存分析采用Kaplan-Meier方法和Log-rank檢驗(yàn)，采用COX回歸分析各因素對(duì)肺鱗癌患者生存預(yù)后的影響，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCDC8、TGF-β1的表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫中CCDC8和TGF-β1在正常肺組織中較腫瘤組織中高表達(dá)(P<0.05)(圖1)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中的1014例NSCLC數(shù)據(jù)中，CCDC8的表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)。在513腺癌數(shù)據(jù)和501鱗癌數(shù)據(jù)中，CCDC8的表達(dá)與TGF-β1表達(dá)也呈正相關(guān)(圖2)。免疫組化檢測(cè)CCDC8、TGF-β1蛋白定位于非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞漿內(nèi)，呈黃色、棕黃色顆粒。CCDC8、TGF-β1在本組病理組織中陽性表達(dá)率分別是41.6%，54.4%(圖3)。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中非小細(xì)胞肺癌中CCDC8與TGF-β1表達(dá)相關(guān)Figure 2 The relationship between the expression of CCDC8 and TGF-β1 in NSCLC from the TCGA databaseNote：A.NSCLC；B.Adenocarcinoma；C.Squamous carcinoma.

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中CCDC8和TGF-β1在正常肺組織及NSCLC中表達(dá)差異Figure 1 The differentiative expression of CCDC8 and TGF-β 1 in normal lung tissues and NSCLC tissues

圖3 免疫組化染色檢測(cè)CCDC8和TGF-β1在NSCLC中表達(dá)Figure 3 Expression of CCDC8 and TGF-β1 in NSCLC by immunohistochemical stainingNote：A.The expression of CCDC8 in adenocarcinoma tissues；B.The expression of TGF-β1 in adenocarcinoma tissues；C.The expression of CCDC8 in squamous carcinoma tissues；D.The expression of TGF-β1 in squamous carcinoma tissues.

2.2 CCDC8和TGF-β1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

在204例病理組織中，CCDC8的表達(dá)與NSCLC組織中TGF-β1的表達(dá)有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度無關(guān)(P>0.05)；TGF-β1表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度無關(guān)(P>0.05)。在鱗癌組織中CCDC8的表達(dá)與TGF-β1表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。在腺癌組織中CCDC8與TGF-β1表達(dá)無關(guān)(P>0.05)(表1)。

2.3 CCDC8、TGF-β1及其他臨床病理特征與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫1 014例NSCLC數(shù)據(jù)中，Kaplan-Meier方法分析CCDC8、TGF-β1表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)。分層分析：在腺癌數(shù)據(jù)中，CCDC8、TGF-β1表達(dá)與患者OS無關(guān)。在鱗癌數(shù)據(jù)中，CCDC8表達(dá)與患者OS相關(guān)；TGF-β1表達(dá)與患者OS無關(guān)(圖4)。204例病理組織中CCDC8和TGF-β1表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)(χ2=2.271，P=0.132；χ2=2.116，P=0.146)。分層分析，腺癌病理組織中CCDC8和TGF-β1表達(dá)與患者OS無關(guān)(χ2=0.002，P=0.967；χ2=0.054，P=0.816)；鱗癌組織中CCDC8表達(dá)與患者OS相關(guān)(圖4)。單因素Cox分析結(jié)果顯示，CCDC8及TNM分期與肺鱗癌患者的OS有關(guān)。將CCDC8、TGF-β1表達(dá)及TNM分期納入多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示CCDC8表達(dá)和TNM分期為肺鱗癌OS的影響因素(表2)。

表1 CCDC8、TGF-β1在NSCLC中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 The correlation between the expression of CCDC8 and TGF-β1 with clinicopathological features of NSCLC

表2 CCDC8、TGF-β1表達(dá)及臨床病理特征與肺鱗癌患者總生存關(guān)系的Cox分析結(jié)果Table 2 Relationship between the expression of CCDC8 and TGF-β1，and clinicopathological features with OS in NLSC

圖4 CCDC8和TGF-β1(高對(duì)比低)表達(dá)的NSCLC患者KM生存曲線 Figure 4 KM survival curves of CCDC8 and TGF-β1 expression in patients with NSCLC(High vs.Low).Note：A.The expression of CCDC8 in NSCLC(TCGA)；B.The expression of TGF-β1 in NSCLC(TCGA)；C.The expression of CCDC8 in NSCLC；D.The expression of TGF-β1 in NSCLC；E.The expression of CCDC8 in adenocarcinoma(TCGA)；F.The expression of TGF-β1 in adenocarcinoma(TCGA)；G.The expression of CCDC8 in adenocarcinoma；H.The expression of TGF-β1 in adenocarcinoma；I.The expression of CCDC8 in squamous carcinoma(TCGA)；J.The expression of TGF-β1 in squamous carcinoma(TCGA)；K.The expression of CCDC8 in squamous carcinoma；L.The expression of TGF-β1 in squamous carcinoma.

3 討論

人類CCDC8基因位于19q13.32，編碼卷曲螺旋結(jié)構(gòu)蛋白8。CCDC8蛋白是一種膜蛋白，目前功能不明，在所有組織中均有表達(dá)。通過親和純化蛋白和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)與CCDC8基因密切相關(guān)的基因有CUL7(Cullin7)、OBSL1(Obscurin-Like1)、P53、DBC1(Deleted in breast cancer 1)、ANKRA2(Ankyrin-repeat protein 2)、YB-1、14-3-3、INF462、ROC1、FBXW8、RCN3、LMNB2、BCR-ABL、RFX7等14個(gè)[3]。當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，CCDC8蛋白促進(jìn)Tip60介導(dǎo)的P53乙?；瘏⑴cP53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。CCDC8蛋白可能通過與細(xì)胞支架銜接蛋白的相互作用參與生長(zhǎng)調(diào)控。突變CCDC8基因通過與泛素連接酶CUL7、細(xì)胞骨架蛋白OBSL1和P53基因相互作用，導(dǎo)致人體生長(zhǎng)發(fā)育受抑制身材矮小的3M綜合征(3M-syndrome)[4]。CCDC8與艾滋病毒(HIV-1)結(jié)構(gòu)蛋白Gag相互作用，誘導(dǎo)Gag的內(nèi)化、多泛素化和降解從而發(fā)揮抗HIV作用[5]。

在癌癥基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫研究中，P90/CCDC8在腫瘤組織中表達(dá)不一致。在腎癌、皮膚癌、胃癌中低表達(dá)，在其它腫瘤中高表達(dá)。65%～80%的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者19號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失，CCDC8、FBXW8、RCN3基因正是位于該區(qū)段內(nèi)[6]。Y盒結(jié)合蛋白基因(Y-boxbindingprotein-1，YB-1)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)，它與CCDC8基因相互作用可抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的增殖[7]。用FLT3-ITD在CCDC8基因敲除的動(dòng)物模型中誘導(dǎo)了急性粒細(xì)胞白血病，而在未敲除CCDC8基因的動(dòng)物中未能誘導(dǎo)急性粒細(xì)胞白血病。CCDC8基因可能是FLT3-ITD誘導(dǎo)急性粒細(xì)胞白血病的重要因素[8]。在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶中，BNC1、GALNT9、CCDC8甲基化程度高，而在原發(fā)灶中甲基化程度很低[9]。這些研究發(fā)現(xiàn)提示CCDC8對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要作用。

CCDC8在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚不明確。本研究用TCGA數(shù)據(jù)庫的非小細(xì)胞肺癌數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CCDC8 mRNA1表達(dá)與TGF-β1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。分別用腺癌和鱗癌數(shù)據(jù)分析CCDC8表達(dá)與TGF-β1表達(dá)均呈正相關(guān)。本研究進(jìn)一步在我院胸外科204例非小細(xì)胞肺癌中利用免疫組化檢測(cè)了CCDC8和TGF-β1蛋白的表達(dá)，并分析了它們與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明，在非小細(xì)胞肺癌中CCDC8和TGF-β1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。在這組患者中，未發(fā)現(xiàn)CCDC8和TGF-β1蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化有關(guān)。我們的研究提示，在非小細(xì)胞肺癌中CCDC8可能與TGF-β1通路相互作用。近年來的研究顯示TGF-β1在腫瘤早期是一種腫瘤抑制因子，能夠有效地抑制造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等增殖。TGF-β1、PTEN、p53家族成員和纖連蛋白等這些因子相互作用有利于維持正常的細(xì)胞表型并消除惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的出現(xiàn)。TGF-β1信號(hào)與CD103整合素信號(hào)結(jié)合，加強(qiáng)CD103與E-鈣粘蛋白的相互作用促進(jìn)T細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架重排，進(jìn)而促進(jìn)肺腫瘤微環(huán)境中的T淋巴細(xì)胞積累和抗腫瘤活性[10-11]。但是在腫瘤的進(jìn)展期，TGF-β1又作為一種腫瘤促進(jìn)因子，刺激組織纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，擾亂免疫功能，刺激血管生成和促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。TGF-β1對(duì)非小細(xì)胞肺癌不同的預(yù)后作用可能與TGF-β1既能抑癌又能促癌有關(guān)[10，13]。李云芬等[14-15]發(fā)現(xiàn)CCDC8在乳腺組織，良性乳腺腫瘤中的表達(dá)明顯高于乳腺癌組織；并發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中CCDC8的表達(dá)與nm23顯著負(fù)相關(guān)。在原發(fā)性腎癌中CCDC8啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率為35%，而正常腎組織中沒有CCDC8甲基化[16]。中國(guó)醫(yī)科大學(xué)的一項(xiàng)研究在147例非小細(xì)胞肺癌組織中檢測(cè)CCDC8表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCDC8在癌旁組織中表達(dá)顯著高于癌組織；并與癌細(xì)胞分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是預(yù)后好的指標(biāo)。下調(diào)CCDC8后A549腺癌細(xì)胞增殖侵襲能力加強(qiáng)[17]。這些研究似乎證明CCDC8是抑癌基因。然而在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌中，CCDC8基因多態(tài)與MKI67表達(dá)有關(guān)[18]。聶建云課題組在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中干擾CCDC8后，癌細(xì)胞的增殖侵襲能力下降，裸鼠成瘤能力下降[19-20]，這又提示CCDC8有促癌作用。在腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌中BNC1、GALNT9、CCDC8經(jīng)常出現(xiàn)表達(dá)異常，對(duì)同一個(gè)患者乳腺癌原發(fā)灶和腦轉(zhuǎn)移灶中這三個(gè)基因進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因在腦轉(zhuǎn)移灶中甲基化程度高，在原發(fā)灶中甲基化程度很低。BNC1和GALNT9甲基化過程發(fā)生在乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的后期，而CCDC8的甲基化發(fā)生在乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的早期[9]。我們推測(cè)CCDC8可能與TGF-β1通路有關(guān)，在不同的組織及疾病不同時(shí)期發(fā)揮不同的作用，既有抑癌作用又有抗癌作用。我們?cè)赥CGA數(shù)據(jù)庫中分析CCDC8及TGF-β1在正常癌旁組織中表達(dá)較NSCLC組織中表達(dá)高，與中國(guó)醫(yī)科大學(xué)的研究結(jié)果一致[17]。CCDC8可能與TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)，在腫瘤早期發(fā)揮抗腫瘤作用。TCGA的鱗癌數(shù)據(jù)中CCDC8 mRNA1表達(dá)與總生存相關(guān)；而在腺癌中CCDC8 mRNA1表達(dá)與總生存無關(guān)；未發(fā)現(xiàn)TGF-β1 mRNA表達(dá)與腺癌和鱗癌的生存相關(guān)。204例病理組織中CCDC8和TGF-β1蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌生存無關(guān)。分層生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCDC8蛋白高表達(dá)、TNM分期晚與鱗癌患者生存期短有關(guān)。多因素Cox回歸分析CCDC8蛋白表達(dá)和TNM分期與鱗癌患者總生存相關(guān)。提示我們CCDC8可能是肺鱗癌預(yù)后指標(biāo)。中國(guó)醫(yī)科大學(xué)的一項(xiàng)研究在147例非小細(xì)胞肺癌組織中檢測(cè)CCDC8表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCDC8與癌細(xì)胞分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；是預(yù)后好的指標(biāo)[17]。我們的研究與他們不一致，可能與兩項(xiàng)研究病例數(shù)較少有關(guān)。還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。我們的研究與TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析基本一致。

綜上所述，在非小細(xì)胞肺癌中CCDC8和TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān)，CCDC8可能是肺鱗癌獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，可能為肺鱗癌的預(yù)后判斷提供新的參考。是否CCDC8與TGF-1一樣在不同的腫瘤及腫瘤的不同時(shí)期作用不同，以及CCDC8表觀遺傳學(xué)的變化對(duì)腫瘤的作用仍需進(jìn)一步研究。