張楊，楊琰，張翌，曹鈞

(1.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科，湖北 武漢430070；2.湖北省婦幼保健院兒童血液科，湖北 武漢430070)

如何抑制肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的復發(fā)一直是國內外研究的熱點[1]。目前已證實上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種重要的腫瘤侵襲轉移機制，是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質細胞表型的生物學過程。研究表明，HCC可經EMT獲得間質細胞特性，增強侵襲能力，發(fā)生遠處轉移[2]。因此，如何通過調控肝瘤細胞EMT抑制其侵襲近年來逐漸受到大家關注。

ADAM家族即去整合素-金屬蛋白酶家族，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其作用是參與調節(jié)細胞之間和細胞與基質間的相互作用。有學者在中樞神經腫瘤中的研究表明，ADAM12可以通過調節(jié)E-cadherin促進腫瘤細胞侵襲[3]。另外，ADAM12可以參與膜鉚釘蛋白活性功能區(qū)的釋放，如肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)，從而調控細胞的增殖。Le Pabic等[4]于2003年首次證實ADAM12在肝癌組織中有表達，并且已證實與HCC的侵襲相關。但是，目前ADAM12與HCC侵襲轉移的具體作用及其機制尚不明確，尤其是ADAM12是否通過調控HCC的EMT來調節(jié)其侵襲尚缺乏相關研究。本研究擬通過臨床資料統(tǒng)計分析與細胞實驗，探討ADAM12與HCC腫瘤病理的關系，及其調控肝癌增殖、侵襲的具體機制。

資料與方法

一、病例與隨訪

2014年1月至2016年1月在本中心因原發(fā)性肝細胞癌行手術治療的病例69例，收集病人的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期等信息，并隨訪至2017年12月31日。

二、免疫組織化學檢測

病理組織標本包埋切片，脫蠟，高溫修復抗原，3%H2O210 min，10%山羊血清室溫封閉1 h；Ki67、ADAM12多克隆兔抗(proteintech，USA)4 ℃孵育過夜。用抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(proteintech，USA)檢測Ki67、ADAM12抗體結合情況并顯色。蘇木素復染，脫水處理，中性樹脂封片。Ki67染色結果由兩位病理科醫(yī)生根據肝癌細胞陽性率進行評分：≤50%評判為Ki67低；>50%評判為Ki67高。ADAM12染色結果由兩位病理科醫(yī)生根據肝癌細胞陽性率進行評分：“+”(1%～24%)，“++”(25%～49%)，“+++”(50%～74%)，“++++”(75%～100%)。

三、細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清(life science，USA)和1%雙抗的DMEM(gibeco，USA)，于5% CO2的37 ℃孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)HepG2、MHCC97H肝癌細胞系(細胞系均由中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科實驗室提供)。

四、慢病毒感染

構建ADAM12干擾LV10-ADAM12(human)和過表達LV8-ADAM12(human)慢病毒(吉凱基因，中國)。感染內接種適量細胞，感染時細胞融合度為50%～70%。感染時，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加1 ml培養(yǎng)基，并加入10 μl的慢病毒(病毒滴度：1×109TU/ml)。72 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞感染率，并用Western Blot檢測ADAM12的表達改變。

五、細胞增殖實驗

在96孔板中每孔接種1×103個細胞，每組設置3個復孔。將細胞剛好貼壁記為0 h，于24 h利用Cell Counting Kit-8(CCK-8；碧云天，China)檢測細胞增殖；每孔加入10 μl CCK-8，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A值)。

六、侵襲實驗

Transwell小室(Millipore，USA)底部鋪入50 μl Basement Membrane Matrix(Corning，USA，稀釋=1∶2)，細胞孵箱中2 h。收獲細胞，制成每200 μl DMEM(GIBECO，USA)中含6×104個細胞懸液。Transwell上室加入200 μl DMEM細胞懸液，下室加入800 μl含10%胎牛血清DMEM，細胞培養(yǎng)箱中侵襲48 h后取出，多聚甲醛中固定，結晶紫中染色，PBS洗凈，并用棉簽輕輕擦拭Transwell小室上室底部。晾干后，將小室倒置于顯微鏡下觀察并拍照，計算細胞數目。

七、Western Blot

于6孔板種植細胞，待細胞貼壁，融合度達到70%～90%時，加入RIPA裂解液(每孔加入150 μl RIPA)，提取細胞蛋白；取組織標本10 mg，加入RIPA裂解液(嚴格按照說明書)，提取組織蛋白；BCA法測定蛋白濃度。Western Blot具體步驟如前所述[5]，一抗(GAPDH，1∶1 000；ADAM12，1∶1 000；E-cadherin，1∶1 000；N-cadherin，1∶1 000；Vimentin，1∶1 000；均購自Proteintech Group，USA)，二抗(羊抗小鼠，1∶2 000；羊抗兔，1∶2 000，Proteintech Group)，ECL反應，曝光機采集信號，GeneTools分析A值，目標蛋白A值與內參照GAPDHA值的比值為相對表達量。

八、統(tǒng)計方法

結 果

一、臨床資料分析

本研究共收集了69例原發(fā)性肝癌病例，病理診斷確診為HCC，年齡為(57.7±12.4)歲，男性53例(76.81%)。腫瘤大小為(5.7±3.5) cm，范圍為0.4～11.3 cm。肝癌TNM分期、WHO肝細胞癌組織分化程度見表1。

二、ADAM12表達與HCC病理之間的關系

對69例原發(fā)性肝細胞癌病人的癌組織樣本進行ADAM12免疫組織化學染色，根據ADAM12染色密度進行評分。其中，評分為0的14例(20.29%)，8例(11.59%)為“+”，17例(24.64%)“++”，20例(28.99%)“+++”，10例(14.49%)“++++”。將評分為0和“+”的免疫組織化學結果定義為低表達，“++”～“++++”定義為高表達(圖1)。結果表明，TNM分期越高，腫瘤分化程度越低，Ki67指數越高，ADAM12高表達的比例越大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1，圖2)。

表1 ADAM12表達與HCC臨床病理之間的關系(例)

三、ADAM12表達與預后之間的關系

術后3年ADAM12低表達組病人復發(fā)9例(40.91%)，而ADAM12高表達組病人復發(fā)34例(72.34%)，差異有統(tǒng)計學意義(2=6.305；P=0.012)，提示ADAM12高表達組腫瘤復發(fā)率明顯升高。

四、ADAM12對肝癌細胞增殖、侵襲的影響

結果發(fā)現在HepG2肝癌細胞系中，抑制ADAM12的表達抑制了細胞增殖，而過表達ADAM12促進了細胞增殖，且差異有統(tǒng)計學意義(對照組：1.03±0.51；ADAM12沉默組：0.74±0.33；ADAM12過表達組：1.75±0.62；F=5.38，P=0.021)。在MHCC97H肝癌細胞系中亦發(fā)現了相似的結果(對照組：1.12±0.36；ADAM12沉默組：0.47±0.24；ADAM12過表達組：1.83±0.56；F=13.86，P=0.000)。上述結果表明，ADAM12促進了肝癌細胞增殖；抑制ADAM12，可以抑制肝癌細胞增殖。

同時，結果發(fā)現抑制ADAM12表達后，HepG2細胞穿膜細胞數明顯少于對照組，而過表達ADAM12組，HepG2細胞穿膜細胞數明顯多于對照組[對照組(144.0±22.8)個，ADAM12沉默組(97.0±25.1)個，ADAM12過表達組(193.0±22.4)個，F=20.93，P=0.000]。在MHCC97H細胞系中亦發(fā)現了相似的結果[對照組(127.0±21.6)個，ADAM12沉默組(95.0±22.0)個，ADAM12過表達組(175.0±23.7)個，F=16.08，P=0.000](圖3)。上述實驗結果表明，ADAM12促進了肝癌細胞侵襲；抑制ADAM12，可以減弱肝癌細胞侵襲。

五、ADAM12對肝癌細胞EMT的調控作用

在HepG2細胞系中，ADAM12沉默組，上皮標志物E-cadherin的表達明顯高于對照組，而間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達則低于對照組；反之，ADAM12過表達組，E-cadherin的表達低于對照組，而N-cadherin和Vimentin的表達則明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。在MHCC97H細胞系中，亦發(fā)現了相似的結果(圖4)。該結果提示，ADAM12促進肝癌細胞EMT，增強了癌細胞間質化。

討 論

肝癌細胞的高侵襲能力是原發(fā)性肝癌預后差、死亡率高的重要原因之一。近年來，防治肝癌侵襲對改善病人預后的意義逐漸被多數學者認可，因此，探討肝癌侵襲的機制是近年來研究熱點[6]。研究表明，肝癌細胞EMT過程是其獲得侵襲能力的關鍵，同時，EMT還影響到肝癌細胞的增殖與血管構建。目前認為，肝癌細胞經EMT獲得間質細胞特性，侵襲能力增強。在惡性腫瘤中，EMT的相關機制與信號通路研究已較深入，其中ERK在EMT中發(fā)揮的關鍵作用亦被多數學者認可[7]。ADAM12作為ADAM家族的重要成員，在多種惡性腫瘤中的作用已得到廣泛研究。但是關于ADAM12在HCC中的作用的研究卻相對匱乏。我們的研究表明，ADAM12通過影響細胞蛋白骨架，尤其是間質標志物(N-cadherin、Vimentin)表達，促進肝癌細胞間質化，影響肝癌細胞增殖、侵襲能力[5，8]。通過抑制ADAM12，可以降低肝癌細胞增殖與侵襲。

ADAM12是去整合素-金屬蛋白酶家族一員，可通過多種機制調控腫瘤侵襲。ADAM12胞外段的金屬蛋白酶區(qū)可通過降解細胞外基質促進腫瘤細胞侵襲；ADAM12可以作用于IGFBP-3的底物，導致IGFBP-3水平下降，導致p53誘導的細胞凋亡下降；ADAM12還可水解HB-EGF，導致其釋放活性外功能區(qū)(sHB-EGF)。sHB-EGF具有較強的致瘤能力和生血管效應，能夠通過激活基質金屬蛋白酶(MMPs)增強細胞侵襲能力，還能夠作為表皮生長因子(EGFR)最主要的配體，促腫瘤細胞增殖[9-11]。由此可見，ADAM12可以通過多種機制調控肝癌的增殖與侵襲。

圖1 肝癌組織中ADAM12免疫組織化學染色 A.分期Ⅰ期病人標本染色，ADAM12低表達，評分“+”；B.分期Ⅳ期病人標本染色，ADAM12高表達，評分“++++” 圖2 肝癌組織中ADAM12檢測 不同TNM分期ADAM12表達差異明顯，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人ADAM12表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期 圖3 沉默或過表達ADAM12后，HepG2、MHCC97H肝癌細胞侵襲能力改變 圖4 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin在HepG2、MHCC97H肝癌細胞系中表達變化

Le Pabic等于2003年首次證實ADAM12在肝癌組織中有表達，其他研究亦證實，ADAM12在HCC中表達豐度明顯高于ADAM8、ADAM9等其他ADAMs家族成員[4，12]。因此，我們推測ADAM12與HCC侵襲相關性可能更大。研究表明，ADAM12表達越高，肝癌分化程度越低，分期晚，腫瘤越大，預后越差。通過探究ADAM12影響肝癌侵襲的機制發(fā)現，ADAM12可通過調控肌動蛋白骨架調控EMT。由于EMT的實質是細胞骨架重塑，其中肌動蛋白絲動態(tài)裝配對維持細胞運動功能具有重要作用。而ADAM12可調控p53信號系統(tǒng)，進一步調節(jié)核轉錄因子NF-κB，調控EMT。通過檢測EMT標志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin發(fā)現[13-14]，ADAM12表達下調可誘發(fā)上皮標志物(E-cadherin)表達上調，而間質標志物(N-cadherin、Vimentin)表達下調；ADAM12表達上調時，間質標志物表達明顯上調，但上皮標志物表達下調。這提示ADAM12可以促進肝癌細胞間質化，增強細胞運動能力。雖然本研究中初步探討了ADAM12對肝癌細胞EMT的調控作用，但是ADAM12調控EMT的具體機制未深入探討。ADAM12是通過增加p53活化影響EMT，還是直接作用于細胞骨架影響EMT仍待進一步探討，這亦是本課題進一步的研究方向。

ADAM12通過調控肝癌細胞EMT，促進肝癌細胞增殖、侵襲。通過抑制ADAM12，可降低肝癌細胞增殖、侵襲能力，這可能為臨床上治療HCC提供新的思路。