蔣如如，李 欣綜述，哈小琴審校

鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由鐵依賴的氧化損傷引起的細(xì)胞死亡模式，與凋亡、壞死、自噬不同，鐵死亡的特征主要是細(xì)胞體積縮小和線粒體膜密度增加，沒有典型的細(xì)胞凋亡和壞死表現(xiàn)[1]。鐵死亡作為非凋亡形式的細(xì)胞死亡于2012年被首次報道，這一過程最初是用合成的小分子化合物在癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)的，但后來報道表明它與腦和其他組織急性損傷的細(xì)胞死亡事件有關(guān)。鐵依賴的細(xì)胞死亡并不是一個新概念[2]，在神經(jīng)退行性疾病和腦損傷研究中均有與鐵和氧化應(yīng)激的病理細(xì)胞死亡事件的諸多描述[3,4]，這一現(xiàn)象可通過誘導(dǎo)鐵死亡來解釋。研究表明，鐵死亡涉及人類疾病，在神經(jīng)退行性疾病和腦損傷研究中發(fā)現(xiàn)許多含有與鐵和/或氧化應(yīng)激的病理細(xì)胞死亡事件的描述[3]，因此，了解鐵死亡通路以及其誘因可能會產(chǎn)生治療腦損傷的新方法。

1 鐵死亡定義

鐵是地殼中第四大常見元素，它在人體中起著舉足輕重的作用。鐵對細(xì)胞存活至關(guān)重要，它參與有氧運(yùn)輸、DNA和ATP合成以及三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈中各種蛋白質(zhì)的輔助因子[5]。鐵，特別是二價鐵的存在，可大大加速人體內(nèi)飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化，鐵參與線粒體氧化磷酸化過程、細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及ATP的產(chǎn)生，鐵沉積所引起的氧化反應(yīng)若超過細(xì)胞的抗氧化能力水平則可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，直接或間接地引起大分子的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。這種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式稱為鐵死亡。鐵死亡與傳統(tǒng)意義上的細(xì)胞凋亡和壞死不同，是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的積累所引起的。鐵死亡不僅存在于癌細(xì)胞中，還存在于神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型系統(tǒng)中的死亡神經(jīng)元中[6,7]，研究發(fā)現(xiàn)鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)在保護(hù)腦細(xì)胞免于死亡方面具有巨大潛力[8]。

2 鐵死亡機(jī)制

2.1 抑制系統(tǒng)XC-引發(fā)鐵死亡 系統(tǒng)XC-是膜Na+依賴性半胱氨酸-谷氨酸交換轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其是由輕鏈亞基(xCT，SLC7A11)和重鏈亞基(CD98hc，SLC3A2)36組成的由二硫鍵連接起來的異二聚體。當(dāng)系統(tǒng)XC-將細(xì)胞內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的同時將細(xì)胞外胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，然后胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為半胱氨酸以進(jìn)行谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成，該轉(zhuǎn)運(yùn)周期與ATP無關(guān)，由高濃度的細(xì)胞內(nèi)谷氨酸驅(qū)動(見圖1)。這使得系統(tǒng)XC-對細(xì)胞外谷氨酸的濃度異常敏感，而在各種腦損傷情況下神經(jīng)細(xì)胞外谷氨酸濃度均明顯升高，抑制系統(tǒng)XC-的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，進(jìn)而引發(fā)鐵死亡。細(xì)胞攝取胱氨酸是GSH合成的關(guān)鍵步驟，而GSH的產(chǎn)生和維持對于保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害至關(guān)重要。

erastin作為鐵死亡的誘導(dǎo)劑，在誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方面與SAS(一種已知的系統(tǒng)XC-抑制劑)作用方式相似，通過使用放射性物質(zhì)標(biāo)記半胱氨酸可觀察到erastin和SAS明顯抑制細(xì)胞對半胱氨酸的攝取。因此，erastin似乎充當(dāng)系統(tǒng)XC-的直接抑制劑，這一結(jié)果表明erastin作用機(jī)制與半胱氨酸依賴的GSH合成相關(guān)，erastin可以通過抑制細(xì)胞攝入胱氨酸進(jìn)而減少GSH的合成，降低細(xì)胞本身的抗氧化應(yīng)激的能力，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。目前使用傳統(tǒng)的生化方法和先進(jìn)的代謝組學(xué)分析表明，使用erastin治療可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH顯著耗盡，而β巰基乙醇(β-mercaptoethanol，β-ME)可逆轉(zhuǎn)erastin和SAS介導(dǎo)的致死作用，且這一過程繞過了系統(tǒng)XC-的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，β-ME通過與細(xì)胞外胱氨酸結(jié)合形成二硫化合物，經(jīng)過不同的轉(zhuǎn)運(yùn)體將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，通過其他途徑增強(qiáng)半胱氨酸的攝取。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明了estrain或SAS誘導(dǎo)的鐵死亡中涉及系統(tǒng)XC-的參與。

2.2 直接抑制GPx4導(dǎo)致鐵死亡 鐵死亡的特征在于毒性脂質(zhì)ROS的鐵依賴性積累(見圖1)，特別是當(dāng)膜多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)由于脂質(zhì)過氧化物酶谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,Gpx 4)失活而失去控制時，鐵死亡就會發(fā)生。GPx4被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的抑制蛋白，它是一種將H2O2和有機(jī)H2O2分解成水或相應(yīng)的醇的酶，GSH是其活化過程中必不可少的輔助因子。因此，鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和SAS可通過耗盡細(xì)胞內(nèi)GSH從而降低GPx4活性，以此提高細(xì)胞質(zhì)和脂質(zhì)中ROS水平，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生萎縮、死亡。

GPxs家族由不同的成員組成，包括GPx1-8，其中GPx4在鐵死亡中扮演比其它成員更重要的角色。RAS選擇性致死性小分子(RAS-selective lethal 3,RSL3)是一種可以直接與GPx4結(jié)合并抑制GPx4活性的脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)劑，它可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物在細(xì)胞內(nèi)積累，隨后引發(fā)鐵死亡。除了erastin，其它鐵死亡誘導(dǎo)劑也已經(jīng)在大量的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些誘導(dǎo)劑包括DPI7、DPI10、DPI12、DPI13、DPI17、DPI18、DPI19和RSL3等，與RSL3一樣，這些誘導(dǎo)劑均可直接抑制GPX4的酶活性而不會耗盡細(xì)胞內(nèi)GSH。因此，RSL3和功能相關(guān)的化合物被歸類為“2類”鐵蛋白誘導(dǎo)化合物(ferritin-inducing compounds,FINs)，以區(qū)別于erastin和其他系統(tǒng)XC-抑制劑。

圖1 鐵死亡作用機(jī)制

2.3 其它可能誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制 電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels，VDACs)，也被稱為膜孔蛋白，是真核細(xì)胞輸送離子和代謝物的跨膜通道，其在線粒體外膜上分布較多。erastin可以與線粒體外膜上的VDAC2和VDAC3結(jié)合，改變膜的通透性，減緩NADH的氧化。除此之外，erastin也可改變VDAC的離子選擇性，導(dǎo)致通道只允許陽離子進(jìn)入線粒體內(nèi)，以引起線粒體功能障礙和氧化劑釋放，最終導(dǎo)致氧化依賴性非凋亡性細(xì)胞死亡，即鐵死亡。

更有研究發(fā)現(xiàn)[9，10]p53可通過p53-SLC7A11軸抑制SLC7A11的表達(dá)，從而阻礙胱氨酸的攝取，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而p53的作用可以通過鐵死亡抑制劑來阻斷。此外，p53還增加了細(xì)胞內(nèi)ROS水平并觸發(fā)ROS誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的鐵死亡。因此，在癌癥的背景下，鐵死亡可作為p53通過抑制鐵死亡下游的通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

3 鐵在鐵死亡中的作用

鐵在鐵死亡的執(zhí)行過程中至關(guān)重要，膜滲透性鐵螯合劑如環(huán)吡酮(ciclopirox，CPX)，311和2,2-聯(lián)吡啶(2,2-bipyridyl，2,2-BP)和膜不可滲透鐵螯合劑如去鐵胺(deferoxamine，DFO)都可有效防止estrain，RSL3以及生理刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡。同樣， TFRC是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的編碼基因，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體是轉(zhuǎn)鐵蛋白-鐵復(fù)合物攝入細(xì)胞所需的物質(zhì)[11]，沉默TFRC編碼基因也可有效預(yù)防由erastin或胱氨酸缺乏所誘導(dǎo)的鐵死亡。反之，補(bǔ)充結(jié)合鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白或可直接利用的鐵(如檸檬酸鐵銨)，但不補(bǔ)充其他二價金屬后加速erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。以上結(jié)果明確了鐵死亡對鐵的需求。盡管目前尚不清楚鐵如何促進(jìn)細(xì)胞的死亡，但鐵螯合劑可抑制鐵死亡，這一結(jié)果明顯的解釋了鐵螯合劑阻斷鐵向氧提供給電子以形成ROS這一過程，進(jìn)而阻斷了鐵的氧化還原作用。

鐵螯合劑根據(jù)其性質(zhì)不同而發(fā)揮不同的作用。親脂性鐵螯合劑可穿過細(xì)胞膜并螯合細(xì)胞內(nèi)游離的“氧化還原性”鐵池，這通過阻斷鐵池中催化可溶性或脂質(zhì)自由基的形成來阻止細(xì)胞死亡，這些自由基可以引發(fā)或傳播氧化性多不飽和脂肪酸碎片。親脂性鐵螯合劑還可直接滅活促進(jìn)膜脂質(zhì)氧化的含鐵酶。與親脂性鐵螯合劑不同，DFO是一種膜不可滲透的鐵螯合劑，其可通過胞吞作用在溶酶體中積累。這表明DFO可能通過螯合溶酶體上的鐵來預(yù)防細(xì)胞鐵死亡。然而，與導(dǎo)致溶酶體破壞的致死性H2O2治療不同，現(xiàn)階段沒有證據(jù)可以直接表明鐵死亡誘導(dǎo)劑如erastin引發(fā)溶酶體死亡。因此，在溶酶體內(nèi)起作用的DFO可有效截獲細(xì)胞中其他位置更直接地促進(jìn)L-ROS形成的鐵，以防止細(xì)胞死亡。鐵螯合劑不僅可以防止鐵死亡，還可以防止H2O2和青蒿琥酯引起的細(xì)胞死亡。然而，這些致命因素引發(fā)的細(xì)胞死亡通常不會被特定的特異性抗氧化劑如Fer-1所阻斷[12]。因此，在大多數(shù)致死性表型中需要聯(lián)合使用鐵螯合劑和親脂性抗氧化劑來明確評估鐵死亡的作用。

4 鐵死亡與腦損傷

Dixon等人首次將鐵死亡于急性腦損傷聯(lián)系起來，確立了這兩個過程相關(guān)的概念。研究發(fā)現(xiàn)將解剖的大鼠海馬切片暴露于高濃度的谷氨酸下可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而這一過程可通過與鐵蛋白抑制素-1或環(huán)吡酮的共處理被抑制(約50%)。隨后研究發(fā)現(xiàn)腦白質(zhì)損傷與脂質(zhì)過氧化水平的升高有關(guān)且補(bǔ)充鐵、抑制GSH的從頭合成以及抑制N-乙酰半胱氨酸可加劇細(xì)胞死亡，這一過程與鐵死亡的機(jī)制一致。在少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡模型中，ferrostatin-1抑制劑及其改良的類似物可以阻斷細(xì)胞死亡。此外，谷氨酸培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的致死性受到ferrostatin-1、liproxstatin-1、鐵螯合劑和其他已知抑制鐵死亡的小分子物質(zhì)所抑制[13]，而Caspase抑制劑Z-VAD-FMK或壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1s不會阻斷這些條件下的細(xì)胞死亡，也不會導(dǎo)致壞死因子復(fù)合物的形成，進(jìn)一步排除細(xì)胞死亡過程中凋亡和壞死的參與。

Tuo等人[14]進(jìn)一步闡明了鐵死亡是體內(nèi)急性病理性腦細(xì)胞死亡的機(jī)制，在單側(cè)短暫性大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)存在的情況下，tau蛋白、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,App)和亞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferrous iron exporter ferroportin,Fpn)與鐵水平的升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠和小鼠模型中，MCAO可導(dǎo)致?lián)p傷半球中鐵水平的升高，這種鐵的積累可引發(fā)鐵死亡。而liproxstatin-1或ferrostatin-1(特異性鐵死亡抑制劑)治療可限制梗死面積，減少M(fèi)CAO引起的行為缺失。MACO通過一種未知的機(jī)制引起缺血導(dǎo)致tau蛋白減少；相反，tau蛋白的減少抑制App調(diào)節(jié)的Fpn依賴性鐵輸出，而鐵輸出的喪失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵的積累和對鐵死亡的易感性增加。另一方面，腦損傷部位局部鐵濃度的升高也可能是有由于損傷區(qū)域附近的血管滲漏導(dǎo)致全-轉(zhuǎn)鐵蛋白的流入所致[15]，增加血液中轉(zhuǎn)鐵蛋白的水平(降低轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度百分比)可有效減少腦損傷并改善神經(jīng)功能，這一過程可能與神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞死亡減少有關(guān)。此外，Zille等人也證明了鐵死亡抑制劑在抑制MCAO誘導(dǎo)的腦損傷中的功效[16]。

腦出血后的腦損傷是由血管破裂和血液滲入腦中引起，這一過程也涉及鐵死亡。血液中血紅蛋白所含的鐵可以通過增強(qiáng)ROS形成和釋放引起神經(jīng)元損傷[4]。Ferrostatin-1或liproxstatin-1可以抑制用血紅蛋白或游離鐵處理的腦切片培養(yǎng)物海馬區(qū)域中的細(xì)胞死亡。暴露于血紅蛋白結(jié)合的鐵導(dǎo)致這些海馬細(xì)胞中GSH耗盡和GPX4失活。在膠原酶誘導(dǎo)的血管損傷的體內(nèi)模型中，在損傷部位或遠(yuǎn)端直接注射鐵卟啉菌抑制劑可減少受損細(xì)胞的數(shù)量和損傷的大小，改善動物的神經(jīng)功能[4]。細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸可以促進(jìn)GSH的產(chǎn)生，細(xì)胞滲透性半胱氨酸類似物N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)可以保護(hù)腦組織免受腦出血相關(guān)細(xì)胞死亡的影響[17]；因此，可認(rèn)為腦內(nèi)出血后的鐵死亡是由GSH合成缺陷引起的。

此外，鐵死亡也與創(chuàng)傷性腦損傷有關(guān)。在創(chuàng)傷性腦損傷的大鼠皮質(zhì)-撞擊模型中，損傷1 h后可檢測到氧化的PE脂質(zhì)水平升高，與GPX4功能的喪失一致[18]。在創(chuàng)傷性腦損傷的小鼠皮質(zhì)-撞擊模型中，在損傷部位處及其附近可觀察到鐵陽性細(xì)胞的減少[19]。此外，通過ferrostatin-1治療發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡和相關(guān)的行為改變得以減少。實(shí)際上，研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于腦損傷中細(xì)胞的死亡方式與其所承受的壓力類型有關(guān)[20]。

5 展 望

關(guān)于鐵死亡，盡管目前我們在理解其誘導(dǎo)機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑方面的研究進(jìn)展越來越多，但仍存在各種問題，其中明確鐵在鐵死亡中的決定性作用將有助于我們理解鐵死亡的發(fā)生和調(diào)節(jié)機(jī)制。盡管各種研究表明鐵死亡與各種疾病有關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、腎衰竭以及腫瘤等，但鐵死亡在人類疾病中的作用仍然是一個謎。由于細(xì)胞對鐵死亡的易感性在不同組織之間變化很大；同樣，細(xì)胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑(例如索拉非尼)的敏感性在不同個體之間存在差異。此外，研究鐵死亡和腦損傷之間關(guān)系的動物實(shí)驗(yàn)通常使用抑制劑(如鐵蛋白)來阻斷細(xì)胞死亡，但目前研究尚未闡明大腦復(fù)雜環(huán)境中誘導(dǎo)鐵蛋白沉積的特定信號。因此，未來研究的一個基本領(lǐng)域涉及腦細(xì)胞中鐵轉(zhuǎn)化過程的生化調(diào)節(jié)。鐵死亡也可能在腦細(xì)胞中表現(xiàn)出更大的調(diào)節(jié)復(fù)雜性或與其他腦特異性細(xì)胞死亡途徑相互作用。

然而鐵死亡在腦損傷動物模型中的成功干預(yù)，目前主要問題將在于鐵死亡抑制劑在臨床應(yīng)用領(lǐng)域中的問題，開始新的臨床試驗(yàn)來檢測鐵死亡抑制劑作為腦損傷期間病理細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子與否也值得進(jìn)一步討論。鑒于鐵螯合劑和抗氧化的小分子在治療腦損傷方面取得了不同程度的成功[21]，現(xiàn)將已知的抗氧化能力結(jié)合不斷補(bǔ)充的鐵死亡機(jī)制的認(rèn)識，可有助于鑒定或開發(fā)特異性阻斷體內(nèi)鐵依賴性ROS積累的化合物，針對這一過程的研究有可能產(chǎn)生對腦損傷的新認(rèn)識和有效治療的新途徑。