施冰，崔慶華，馮振龍，李俊峽

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心干一科，北京100700;2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物信息學(xué)系；3.安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院)

急進(jìn)高原后急性高山病(AMS)的發(fā)病率居高不下，其中高原心臟疾病是很重要的一部分[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，高原環(huán)境運(yùn)動(dòng)者30%的死亡與高原心臟病猝死相關(guān)[2]。高原心臟病的發(fā)生發(fā)展比較復(fù)雜[3],尤其對急進(jìn)高原后心臟的影響還不甚清楚[4]。前期實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用低氧實(shí)驗(yàn)艙模擬海拔7000 m高原環(huán)境，應(yīng)用超聲心動(dòng)圖評估了SD大鼠在急進(jìn)高原后不同時(shí)間點(diǎn)(3 d、7 d、14 d、28 d)心臟結(jié)構(gòu)和功能變化，HE染色病理切片評估了心肌組織病理變化。發(fā)現(xiàn)急性高原低氧可造成大鼠心肌組織水腫，心臟收縮和舒張功能嚴(yán)重受損。急進(jìn)高原第7天時(shí)大鼠心臟收縮功能受損最嚴(yán)重[5]。目前國內(nèi)外對于AMS發(fā)生機(jī)制尚不十分明確，還沒有非常有效的干預(yù)策略。雖然很多研究已證實(shí)炎性因子、氧化應(yīng)激等在急性高原病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，但均不足以從基因水平全面闡述急性高原病發(fā)生機(jī)制，也不足以篩選新的防治急性高原病的藥物。本研究擬通過低壓氧艙模擬高原低氧環(huán)境，建立急性高原病大鼠動(dòng)物模型。通過對高原低氧暴露7 d大鼠心肌組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，篩選與急性高原病相關(guān)的差異表達(dá)基因。應(yīng)用Connectivity Map數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析比對，通過生物信息學(xué)方法篩選潛在的防治急性高原病的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組 選取6周齡SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，雄性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。許可證號：SCXK(京)2016-0006。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過倫理委員會審核。采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為高原低壓低氧實(shí)驗(yàn)組(HH組)、常壓常氧對照組(con組)、藥物干預(yù)組(Sb203580組)。每組20只動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)條件 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)艙(貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)模擬高原低氧條件。實(shí)驗(yàn)艙參數(shù)設(shè)定：模擬海拔高度7000 m，升降速度10 m/s，艙內(nèi)壓力39.1 kPa，艙內(nèi)氧氣壓力9.022 kPa。實(shí)驗(yàn)組和藥物干預(yù)組大鼠均置于實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)。實(shí)驗(yàn)艙運(yùn)行時(shí)間23 h/d，晝夜比12 h∶12 h。每日上午開倉1 h更換墊料、飼料、飲用水。藥物干預(yù)組大鼠于每天開倉時(shí)腹腔注射SB203580溶液 (10 mg/kg)，每日注射1次，每只大鼠連續(xù)注射7 d。對照組大鼠置于實(shí)驗(yàn)艙外，處理等同于實(shí)驗(yàn)組大鼠。

1.3 方法

1.3.1 大鼠心肌組織總RNA提取 各組大鼠飼養(yǎng)7 d后處死，開胸取出心臟。應(yīng)用Trizol試劑提取心肌組織總RNA。取100 mg心肌組織樣品，加入1 mL RNAstore樣本保存液。按照Trizol試劑說明書，一步法提取心肌組織總RNA。采用RNeasy Mini Kit純化總RNA，應(yīng)用NanoDrop2000分光光度計(jì)分別測量RNA在波長為260 nm、280 nm的吸收值，間接計(jì)算出提取的RNA濃度。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。

1.3.2 大鼠心肌組織mRNA高通量測序 質(zhì)檢合格的RNA進(jìn)行文庫構(gòu)建。使用HiSeq2500進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組高通量測序(實(shí)驗(yàn)組和對照組各6只動(dòng)物)，獲得mRNA表達(dá)譜。使用FastQC對原始序列進(jìn)行檢測，保留高質(zhì)量的整潔序列(clean reads)。使用Cufflinks 2.0 對所有轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行匯總整合，并使用Ensemble轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫對獲得的結(jié)果進(jìn)行注釋。使用Cufflinks軟件篩選差異基因。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以下條件：①在兩個(gè)樣本中測序讀數(shù)之和》10的基因；②滿足│log2(FC)│>1(上調(diào)2倍或下調(diào)2倍)；③同時(shí)滿足P<0.05和FDR(false discovery rate)<0.05。高通量測序檢測由北京博奧公司完成。

1.3.3 差異基因GO分類和Pathway分析 應(yīng)用SAM軟件篩選出實(shí)驗(yàn)組和對照組比較，相對表達(dá)超過2倍的差異基因。應(yīng)用可視化和整合發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(DAVID )軟件對差異基因功能進(jìn)行基因本體(GO)分類、生物學(xué)通路(Pathway)分析、功能注釋聚類分析，獲得差異基因相關(guān)功能的功能富集類。

1.3.4 connectivitymap藥物數(shù)據(jù)庫篩選與高原低氧作用機(jī)制拮抗的藥物 應(yīng)用生物信息學(xué)工具ConnectivityMap數(shù)據(jù)庫，整合差異表達(dá)mRNA信息，推測高原低氧相關(guān)心肌損傷中差異表達(dá)基因與藥物小分子功能的關(guān)系。將比對系數(shù)OR<1且P<0.05的藥物定義為具有防治急性高原病的效應(yīng)。

1.3.5 心肌組織含水量檢測 各組動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS溶液漂洗，濾紙吸干。用電子天平稱量心臟濕質(zhì)量后，置于80 ℃恒溫干燥箱烘干48 h 至恒質(zhì)量，稱重心臟干質(zhì)量。計(jì)算組織含水量=(濕重-干重) /濕重×100%。

1.3.6 心肌組織病理學(xué)檢測 各組動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)處死后，剖開胸腔，無菌條件下取出心臟。4 ℃ PBS溶液漂洗，濾紙吸干。組織用40 mL/L多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切5片，片厚約4 μm，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.3.7 心肌組織AQP1 mRNA檢測 應(yīng)用real time PCR技術(shù)檢測心肌組織AQP1 mRNA表達(dá)。通過Reverse Transcription Kit試劑盒將心肌組織RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行AQP1 mRNA相對表達(dá)水平測定。檢測總體系為25 μL(其中上下游引物各0.5 μL、Premix 12.5 μL,cDNA模板2 μL、ddH2O 9.5 μL)。PCR程序參照試劑盒中提供的兩步法檢測:95 ℃ 30 s,95℃5 s,60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。以β-actin作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量,引物由上海生工合成。AQP1上游引物為5’-GCCAGCGAGTTCAAGAAG-3’，下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。β-actin 上游引物為5'-TTCGCGGGCGACGATGC-3'，下游引物為5'-CGAAGTCCAGGGCGAC-3'。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織差異表達(dá)基因篩選 將相對表達(dá)量比值在2倍以上，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的mRNA作為差異表達(dá)mRNA。與對照組比較，高原低氧實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織中1 084個(gè)mRNA表達(dá)發(fā)生顯著變化。其中457個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，627個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)(圖1)。圖1中，橫軸和縱軸分別表示對照組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量值。紅色的點(diǎn)代表上調(diào)基因，綠色的點(diǎn)代表下調(diào)基因，黑色的點(diǎn)代表無顯著差異的基因。

圖1 大鼠心肌組織差異表達(dá)mRNA的散點(diǎn)圖

2.2 潛在防治急性高原病的藥物篩選 應(yīng)用高通量測序獲得的上調(diào)基因和下調(diào)基因,建立QuerySignature格式文件。然后進(jìn)入cMap網(wǎng)站(http://www.broadinstitute.org/cniap/),分別導(dǎo)入上調(diào)基因和下調(diào)基因的文件,按使用說明操作進(jìn)行藥物表達(dá)譜分析。通過與cMap數(shù)據(jù)庫中己有參考基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,獲得每一次比對分值在1和-1之間的富集分值 (enrichment)。富集分值代表輸入的表達(dá)譜數(shù)據(jù)與比對的相應(yīng)表達(dá)譜數(shù)據(jù)的相似程度。正分值表示與cMap相應(yīng)表達(dá)譜數(shù)據(jù)有著較高的相似性,負(fù)分值表示輸入的表達(dá)譜與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)表達(dá)譜表達(dá)模式相反。根據(jù)比對結(jié)果，認(rèn)為小分子化合物SB203580(OR=0.047,P=0.04)具有潛在的預(yù)防急性高原病效應(yīng)。

2.3 小分子化合物SB203580防治急性高原心肌損傷的效果

2.3.1 大鼠心肌組織含水量 與對照組比較，低氧組和SB203580組大鼠心肌組織含水量均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠心肌組織含水量降低(P<0.05)。提示SB203580可減輕高原低氧導(dǎo)致的心肌水腫。

2.3.2 大鼠心肌組織病理 心肌組織病理切片(光學(xué)顯微鏡,×200倍)提示對照組心肌細(xì)胞界限清楚，可見肌原纖維和橫紋，核清晰。低氧組可見心肌灶狀變性，心肌水腫、肌束稀疏。SB203580組偶可見心肌灶狀變性。根據(jù)心肌組織病理變化，提示SB203580可減輕高原低氧導(dǎo)致的心肌損傷。見圖2。

2.3.3 大鼠心肌組織AQP1mRNA表達(dá) 與對照組比較，低氧組大鼠心肌組織AQP1mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，SB203580組大鼠心肌組織AQP1mRNA表達(dá)量未見顯著變化(P>0.05)。與低氧組比較，SB203580組大鼠心肌組織AQP1mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。提示SB203580可下調(diào)高原低氧大鼠心肌組織AQP1mRNA表達(dá)。見圖3。

3 討論

生物信息學(xué)綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)等多學(xué)科知識和工具,闡明和揭示大量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義。隨著高通量測序和生物信息學(xué)的出現(xiàn),藥物發(fā)現(xiàn)模式發(fā)生了重大變革。由既往偶然發(fā)現(xiàn)、工業(yè)合成有效成分的傳統(tǒng)時(shí)代進(jìn)入一個(gè)以基因?yàn)榛A(chǔ)的藥物研發(fā)新階段。近年來,基因表達(dá)譜在藥物研究方面的應(yīng)用越來越廣泛,研究人員構(gòu)建了與活性化合物或藥物相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫,繪制了“基因-疾病-藥物”之間的關(guān)系圖。這些“關(guān)系圖”為藥物發(fā)現(xiàn)及研究提供了新思路,形成一種獨(dú)特的藥物發(fā)現(xiàn)新模式,即基于化合物或藥物基因表達(dá)譜的藥物發(fā)現(xiàn)模式。通過該方法可篩選到一些疾病治療候選化合物,加快了藥物發(fā)現(xiàn)過程,特別是對于那些臨床罕見疾病的治療藥物發(fā)掘有著更為重要的意義。

注：與常壓常氧對照組比較，aP<0.01；與高原低壓低氧實(shí)驗(yàn)組比較，bP<0.01

圖3大鼠心肌組織AQP1mRNA檢測

Connectivity map (cMap)數(shù)據(jù)庫是美國麻省理工學(xué)院、哈佛大學(xué)及其附屬醫(yī)院聯(lián)合開發(fā)的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫應(yīng)用基因表達(dá)譜信號揭示藥物-基因-疾病之間的相互聯(lián)系。通過對比不同藥物之間在基因組表達(dá)譜上的相關(guān)程度，即可判斷藥物在調(diào)控下游基因的方式上的相似程度，也就間接反映了不同藥物是否影響了相近的或部分重疊的下游基因。為了定量衡量一對藥物表達(dá)譜之間正向或負(fù)向的相關(guān)程度，CMap根據(jù)特定的計(jì)算方法能夠給出一個(gè)介于-1和+1之間的“聯(lián)系分值”，用以定量衡量各藥物表達(dá)譜之間的相似程度。當(dāng)前cMap數(shù)據(jù)庫包含超過7 000個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù),涉及多達(dá)1 300種化合物,可應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)具有相似作用的藥物,提示藥物的作用機(jī)制,以及從FDA目前己有藥物中發(fā)現(xiàn)老藥的新用途。

水通道蛋白(AQP) 是一類廣泛分布于機(jī)體不同組織器官中的特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水的膜蛋白，共有13個(gè)亞型?？梢源龠M(jìn)水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力的平衡[6]。在心臟表達(dá)的水通道蛋白主要是AQP1亞型。文獻(xiàn)報(bào)道，在人類和大鼠心肌組織中，AQP1主要分布于無孔型血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，協(xié)調(diào)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。生理狀態(tài)下，AQP1蛋白對于水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)影響并不明顯。病理狀態(tài)下，AQP1在缺氧條件下被誘導(dǎo)表達(dá)[7]。山羊體外循環(huán)手術(shù)后心肌組織中AQP1高表達(dá),且與心肌水腫程度密切相關(guān)[8]。應(yīng)用AQP1慢病毒載體轉(zhuǎn)染羊心肌組織后,心肌組織AQP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均呈升高趨勢,心肌組織AQP1表達(dá)水平與心肌水腫程度呈正相關(guān)。敲除AQP1基因后,心肌水腫程度明顯降低[9]。心肌細(xì)胞水腫壞死是導(dǎo)致心肌缺血和各種繼發(fā)性損傷的重要環(huán)節(jié)之一。調(diào)節(jié)AQP1的表達(dá)是防止心肌水腫的一個(gè)重要途徑。臨床研究表明AQP1主要受上游ERK/MAPK、PI3K/AKT/m TOR等通路的調(diào)節(jié),進(jìn)而促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶、VEGF等基因表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成[10]。通過cMap數(shù)據(jù)庫分析比對，我們推測小分子化合物SB203580是潛在的具有防治急性高原低氧心肌損傷的候選藥物。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組比較,低氧組大鼠心肌組織出現(xiàn)水腫、壞死，心肌組織中AQP1 mRNA表達(dá)顯著增高。SB203580組大鼠盡管心肌含水量輕度增高，但心肌組織病理未見顯著變化，心肌組織AQP1mRNA表達(dá)無顯著變化。SB203580是一種常用p38MAPK抑制劑，可以通透細(xì)胞，抑制p38MAPK激活，進(jìn)而有效抑制一些炎性因子(如IL-1β、TNF-α)介導(dǎo)的部分信號傳導(dǎo)。本研究結(jié)果提示，SB203580可通過調(diào)控心肌組織AQP1表達(dá),防治高原低氧導(dǎo)致的心肌水腫和心肌損傷。

本研究基于高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)，從全轉(zhuǎn)錄組水平初步揭示了高原低氧大鼠心肌損傷的作用機(jī)制。結(jié)合已知的基因功能和信號通路，以及cMap數(shù)據(jù)庫分析比對結(jié)果，初步預(yù)測了潛在的具有干預(yù)急性高原心肌損傷的藥物并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過本研究，將深化有關(guān)急性高原病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識,為探索新的防治策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。