闞秋琪，劉康軍，孫瑩慧，李建基，崔璐瑩，孟霞，朱國強，王亨

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009 )

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最普遍、經濟危害最嚴重的一種疾病，其病因復雜，通常由微生物引起，其中無乳鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌是最主要致病菌[1]。由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有治愈率低，復發(fā)率高的特點。同時，抗生素的濫用導致金黃色葡萄球菌的耐藥性愈來愈強，嚴重阻礙了奶牛業(yè)的發(fā)展。本試驗對從江蘇某奶牛場乳房炎患牛奶樣中分離的金黃色葡萄球菌進行了藥物敏感性試驗，篩選出有效藥物，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 奶樣采集

經臨床檢查和CMT檢測，共計從江蘇某奶牛場收集55份乳房炎患牛奶樣。

1.2 主要試劑及儀器

胰蛋白胨和酵母提取物，購自OXOID公司；Baird-Parker瓊脂，購自青島海博生物技術有限公司；瓊脂粉，購自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司；質控標準品、甲酸、基質溶液和MALDI Biotyper微生物鑒定系統(tǒng)，購自德國布魯克公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌的分離純化

將奶樣搖勻后接種于Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，然后觀察及記錄菌落的形態(tài)，挑取疑似金黃色葡萄球菌的菌落，即黑色、周圍有白色渾濁帶，且最外圍有一透明環(huán)的菌落，將其接種于LB固體瓊脂培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。

1.4 細菌的鑒定

使用MALDI Biotyper系統(tǒng)對純化后的細菌進行鑒定。首先在MALDI靶板上加1μL質控標準品，自然干燥，然后將純化后的單個菌落直接涂抹于其他位點，再加入70%的甲酸水溶液1μL，自然干燥，最后分別在質控標準品和菌落涂層上加1μL基質溶液，待其自然干燥后放入質譜儀，通過Flex Control和MALDI Biotyper RTC 篩選出特異性的指紋圖譜，與Biotyper數據庫進行比對，完成微生物的鑒定[2]。

1.5 耐藥性試驗

采用紙片擴散法進行藥敏試驗，對12種抗生素(青霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、丁胺卡那、卡那霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、克林霉素)進行耐藥性試驗，判定標準見表1。

表1 耐藥性試驗判斷標準

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

本試驗從55份乳房炎奶樣中共分離出8株金黃色葡萄球菌（編號分別為1～8），檢出率為14.55%(8/55)。

2.2 耐藥性試驗

表2 8株金黃色葡萄球菌分離株的耐藥結果 單位：mm，%

采用紙片擴散法對8株金黃色葡萄球菌進行了12種抗菌藥物的耐藥性試驗。結果顯示，金黃色葡萄球菌對12種抗生素均存在一定程度的耐藥。其中，對青霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率最高，均為100%，其次，對阿莫西林的耐藥率也達到較高水平，為75%，極少數對頭孢氨芐、慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素耐藥，而8株金黃色葡萄球菌對四環(huán)素、多西環(huán)素均敏感，對克林霉素敏感或中敏（表2）。

3 討論

在本次試驗中，金黃色葡萄球菌的檢出率為14.55%。查閱相關文獻，田曉英等[3]報道天津地區(qū)生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為58%，田會麗等[4]報道石河子地區(qū)的金黃色葡萄球菌檢出率為70.83%，兩者均高于本試驗結果；但與章慧等[5]報道的上海生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率（13.33%）基本一致，Anderson等[6]報道的美國東南部地區(qū)牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率（13.6%）與本試驗結果也基本一致，各地方的流行菌種不同可能是檢出率差異性顯著的原因。

本試驗分離的8株金黃色葡萄球菌分離株均呈現多重耐藥，對β-內酰胺類抗生素(青霉素、阿莫西林)的耐藥水平極高，尤其對青霉素已產生完全耐藥性，高于高潮等[7]報道的上海地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對青霉素的96.8%耐藥率，低于其報道的對阿莫西林的100%耐藥率；對氨基糖苷類抗生素中的鏈霉素達到完全的耐藥率，遠高于劉敬蘭等[8]報道的北京地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對鏈霉素53%的耐藥率，而對慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素的耐藥率較低；對喹諾酮類抗生素中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率為100%，而對克林霉素敏感率達100%，前者耐藥率遠高于王冰等[9]報道的呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對喹諾酮類抗菌藥21%～32%的耐藥率；對頭孢類的頭孢氨芐的耐藥率為25%，遠低于張倩等[10]報道的石河子地區(qū)的66.67%耐藥率；對四環(huán)素類抗菌藥耐藥率為0，遠低于燕霞等[11]報道的浙江地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對四環(huán)素60%的耐藥率。以上數據表明，各地區(qū)奶牛場的金黃色葡萄球菌分離株對各種抗生素的敏感程度存在很大差異，這可能是不同奶牛場不同用藥習慣所導致的。

本試驗的8株金黃色葡萄球菌分離株均呈現嚴重的耐藥現象，其中對β-內酰胺類和喹諾酮類的抗生素耐藥率極高，其原因可能與其所含耐藥基因的活躍表達有關。目前已有研究結果表明，β-內酰胺類耐藥基因為mecA、femA，氨基糖苷類耐藥基因為aac(6＇)/aph(2＇＇)，喹諾酮類耐藥相關基因為norA、gyrA、grlA，四環(huán)素類耐藥基因為tetA、tetB、tetC、tetD，這些耐藥基因可使金黃色葡萄球菌極易產生耐藥性。不同地區(qū)、不同奶牛場的細菌耐藥性存在差異，臨床用藥時需根據實際情況合理用藥。

金黃色葡萄球菌能夠導致乳腺細胞損傷，并能在上皮細胞或者吞噬細胞（如嗜中性粒細胞）中存活，故控制該菌引發(fā)的乳房炎最有效的方法是保持環(huán)境衛(wèi)生、牛體清潔，減少或者消除牛群之間的傳播，減少乳頭污染和感染的機會，及時發(fā)現病牛并隔離，通過細菌分離鑒定和藥敏試驗選擇敏感藥物進行治療或者淘汰。此外，通過加強飼養(yǎng)管理、補充維生素或者硒制劑[12,13]、平衡飼料中的銅和鋅的水平，均可以在一定程度上減少該疾病的發(fā)生。